栽培种在菌种级别中为三级种，是由原种扩大延续繁殖的下一层。每瓶原种一般可扩接栽培种50～60瓶。银耳栽培种的菌龄，一般7～12天均可，最适为8～10天，就可用于栽培生产，比其他菇类时间短。但其培养基含水量可稍高些，有利银耳酵母状分生孢子的出现，使孢子渗透培养基深层同耳友菌丝混合，可以弥补银耳菌丝吃料不深的缺陷，使出耳率更高，更稳定。
银耳原种扩接栽培种时，将二级种表层幼耳和菌被刮除，取料下4厘米以内或占瓶内菌丝体1／2量的菌丝体，捣碎并使纯白菌丝与耳友菌丝充分拌匀，二级种接入瓶内后，用手掌拍打瓶壁，使菌种均匀散布料面。接种后的排瓶、控温、光线、通风管理方法同二级种。三级种成熟标准是菌龄7～12天，羽毛状耳友菌丝伸人料层2／3，料面呈现许多米粒状大小白毛团。