从孢子、子实体、菇（耳）木分离培养出来的菌丝体称为母种（一级种）。按分离过程中银耳纯白菌丝、香灰菌丝是分别分离或是一道分离，可分为纯种分离法与混合分离法；按其菌丝体来源，又可分为孢子弹射分离法、组织分离法和基内分离法。
（1）纯种分离分
①孢子弹射法，它是利用成熟的子实体能自动弹射担孢子，经培养以获得银耳纯白菌丝的方法。
②基质块风干分离法，该法是利用银耳纯白菌丝与香灰菌丝耐旱力不同而制定的。将新鲜的银耳分离材料进行充分脱水干燥，不耐旱的香灰菌丝先枯死，耐旱活着的银耳纯白菌丝就能被分离出来。
③香灰菌丝分离法：段木中分离香灰菌丝，在野生银耳生长的木头中或栽培银耳的段木当中都存在抗逆性及分解基质能力强的香灰菌丝，这些经过驯化培养后性状都十分优良，而袋栽银耳的培养基里的香灰菌丝经反复移植后生命力不如前者旺盛。
分离时选取子实体洁白、朵大、开瓣清楚、无病虫害、无烂头和无其他杂菌的种木，在靠近子实体基部截取一段做分离材料。在接种箱内，去除子实体，用福尔马林和高锰酸钾进行熏蒸灭菌，从木材断面可以看到褐色大理石状花纹，从褐色花纹较密处切下一小块木材，用0.1％升汞溶液进行表面消毒，后放在灭菌的培养皿内，用经火焰灭菌过的解剖刀，削去木材外部，再用刀尖将木材切成粗细如同火柴梗，长为0.5厘米的小段，取一小段接人PDA斜面上。每次分离要接30～50管，置于24～28℃下培养，5～6天后，菌丝萌发，随着培养时间延长，菌丝产生色素溶入培养基中，使之变黑色。当菌丝长至斜面1／2时，挑取菌落前端的菌丝，转管纯化，可以得到纯香灰菌丝体，供银耳纯白菌丝混合培养用。
木屑培养基中分离香灰菌丝在接种箱无菌条件下，打破银耳菌种瓶底或在银耳袋栽培养基深层，选香灰菌生长地方，即如大理石状黑色花纹上，挑取米粒大小培养基接种于PDA斜面上，在24～28℃下培养，2天后，斜面上接种点会出现灰白色菌丝，继续培养1～2天，气生菌丝呈绒毛状，能分泌黑色素使培养基逐渐变为棕黑色。菌丝长至斜面1／2时，挑取生长旺盛、爬壁力强的香灰菌丝的前端，转管纯化，在24～28℃下培养4—5天，可以得到纯香灰菌母种。
（2）混合分离法
①基内混合分离法，基内混合分离是利用银耳子实体基部混合生长着银耳纯白菌丝和香灰菌丝，分离培养后即得到银耳菌种。
②单团分离法，单团分离法速度快，可在短期内生产出大量菌种。但只能一次性使用，反复使用易引起香灰菌丝退化而影响产量。
③耳片分离法（组织分离法），在新鲜的银耳叶片表面，粘附着许多香灰菌丝，用耳片分离培养，也会获得银耳菌种。