银耳培养基分为琼脂培养基和木屑培养基。前者为培养母种之用，后者主要为培养原种和栽培种用的。
（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（通称PDA培养基）
配方：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水l000毫升。
制法：①马铃薯洗净，去皮，已发芽的要挖掉芽眼，称取200克，切成薄片或小方块，置于铝锅中，加水1000毫升煮至透熟。②用四层纱布过滤去渣，取马铃薯汁，又置于洗净铝锅中。③将20克琼脂剪碎，放入铝锅中，用文火加热，并不断搅拌使之溶化。若琼脂含杂质多，用六层纱布过滤。④补足水l000毫升，然后加入葡萄糖20克。⑤用试纸测定pH，pH调节到6.5。⑥趁热用漏斗分装入试管内，装置为试管长1／4～1／5，塞上棉塞，直立放于试管笼上。分装时应该注意不能有培养基粘附在试管口附近壁上，以免发生杂菌感染。
（2）马铃薯磷酸二氢钾琼脂培养基
配方：马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，琼脂20克，水1000毫升。
制法：与培养基（1）相似，只是在加入葡萄糖时，同时加入磷酸二氢钾，稍煮几分钟后，趁热装入试管中，塞好棉塞，直立放于试管笼上。
（3）完全培养基
配方：硫酸镁O.5克，磷酸二氢钾0.46克，磷酸氢二钾l克，蛋白胨2克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水1000毫升。
制法：①将配方中药品（琼脂除外）置于烧杯中，用少量水溶化。②量取1000毫升蒸馏水，将琼脂碎片煮溶。③将溶化的化学药品倒人琼脂液中搅匀。④补足水至1000毫升。其他操作与培养基（1）相似。
用于培养银耳芽孢，有利于与香灰菌交合。
（4）木屑银耳菌丝体菌种含磷琼脂培养基
配方：银耳木屑菌种2瓶（’750毫升），纯过磷酸钙1克（或磷酸二氢钾3克），琼脂25克，水1（000毫升。
制法：①取银耳菌种2瓶挖出，置入2000毫升水烧煮，烧开后再煮10～15分钟，过滤去渣，取用滤汁，不足1000毫升加水补足。②加入剪碎的25克琼脂煮溶。③放人纯过磷酸钙或磷酸二氢钾搅匀。④分装试管，塞上棉塞，立放于试管笼中。
适合银耳芽孢萌发菌丝。
（5）黄豆芽葡萄糖琼脂培养基（在马铃薯缺乏季节，可代替PDA培养基）
配方：黄豆芽200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。
制法：①称取黄豆芽200克放在铝锅中，加水1000毫升，用文火煮沸5分钟，用4层纱布过滤去渣，取用滤汁。其他操作顺序见培养基（1）。
还有黄豆粉糖含磷琼脂培养基、麸皮硫酸镁琼脂培养基、米粉冻琼脂培养基、木屑糖含磷琼脂培养基、马铃薯淀粉综合培养基的制作方法这里就不一一叙述了。
以上各种培养基配制后，装入试管，塞好棉塞，每6～8支扎成一捆，用牛皮纸包好管口棉塞，以免灭菌时水气浸湿棉塞。然后直立于手提高压灭菌锅内，拧紧锅盖灭菌。在压力1.47×105帕时，保持30分钟取出，趁热斜靠在桌上的小木板条上，使斜面长达1／2～2／3试管，冷却后即成固体斜面培养基。如果天气冷，在试管上盖毛巾，让培养基慢慢冷却，可避免冷却过快，试管壁上凝结过多的水珠。
每批经灭菌的斜面培养基，抽取3～5支，放在25℃恒温箱中培养3天，若斜面上没有杂菌发生，说明灭菌彻底，可用于接种。