无菌操作也叫无菌接种，是指在严格的无菌条件下进行的菌种移植操作。无菌操作技术在菌种生产中是一项十分重要基本技术。斜面母种转接新制的试管斜面，斜面母种接人原种瓶，原种接入栽培瓶，栽培种接人栽培料袋等，操作略有差异，但基本程序，特别是无菌要求是一致的。
操作要点是：①接种空间（室或箱）要彻底灭菌，用药物喷洒或紫外灯照射交叉进行。②接种人员进入接种室，一定要在缓冲室换上经灭菌消毒的工作帽、衣、鞋。双手要洗干净，并用75％酒精消毒。伸人接种箱的双手，要戴上灭菌过的乳胶手套。③菌种所暴露或通过的空问，必须是无菌区。试管口、菌瓶口须用酒精火焰封住，但不必放在火焰上，以免管口、瓶口烧得红热而烫死菌丝。④各种接种工具应经火焰灼烧灭菌，须在管内、瓶内壁冷却后再取菌种，所取菌种块不得在火焰旁停留，更不能通过火焰，以免烧伤菌丝。⑤拔出棉塞不得与未灭菌的物体接触，管口或瓶口也不得和其他物体接触。重新塞入棉塞需经火焰灭菌。⑥接种时拔去棉塞的试管或菌瓶，应立即以火焰烧灼试管口或菌瓶口，并适当转动，以杀死大部分杂菌，少数未死者也被固定，不致脱落。⑦抽出接种针后，将试管口或瓶口在火焰上烧灼，塞上经火焰灭菌过的棉塞。不要用试管口去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不清洁空气。⑧每次操作时间不宜超过1小时，以免室内和箱内空气交换而潜进杂菌。箱内温度不要超过30℃。高温季节制种时，应在早晚气温低时操作，或在室内采取降温措施进行接种。