达·芬奇在佛罗伦萨的寓所就有这样一个画肖像用的院子。他的房东是佛罗伦萨高贵的公民，彼罗·狄·布拉楚·马特里先生——在政府执务，爱算学，聪明，且很敬重达·芬奇。这寓所在马特里街上。历经四个春秋，肖像画《蒙娜丽莎》完成了。画上的蒙娜丽莎坐在安乐椅上，双手交叠放在胸前，脸上露出勉强可以看出的微笑，像是微笑刚开始的一瞬间，也像是微笑结束的一瞬间。双手柔美、纤秀、富于表情，与她温柔、娴静、美丽的脸部表情相互呼应。她的眼睛特具神采，目光锐利而脉脉含情。薄如蝉翼的透明面纱，笼罩在蒙娜丽莎的头部与双肩，它把披肩上的两绺长发和肩部外衣的曲小的褶襞梳理成为统一、流畅的轮廓。袒露的胸部，显示了青春的女性美。瓦萨里说过：“细看她脖子下面的凹处，仿佛可以看到血脉的搏动。”在衣饰上，达·芬奇在画面上又取消了一切华丽的装饰，但对胸襟和衣袖的褶襞作了精细的描写。衣纹自然逼真，表现了软缎的轻软光亮的质感。达·芬奇根据当时的社会风尚，女子因好广额，将眉刮去，所以他没有给蒙娜丽莎画眉毛。这又使得画中人物增添了一种大理石雕塑的意味。
达·芬奇在这幅画中表现出来的精彩绝伦的技巧，无疑达到了登峰造极的地步。画上的一切都是清晰而准确的，连同衣服的微小皱纹，围绕雪白胸膛的黑色花边，都画得可以乱真。同时，达·芬奇在蒙娜丽莎的脸部、胸部和手部，使用了他所特有的“明暗转移法。用他喜欢的薄暗的光，使蒙娜丽莎脸上和手上仿佛罩着一层黄昏时的光影，显示出柔和而富于诗意的调子。在背景处理上，达·芬奇用左右两边隐约可以看出圆柱的基础和石栏，把近景和远景区分开来。他使用“空气透视法”将远景推向无限深远之处。那些古老的岩石，天蓝色的钟乳般的山峰，还有在岩石中间蜿蜒流淌着的河流，这一切仿佛笼罩在模糊的薄雾里，然后消失在无限深远的青色的云海中。这个背景把蒙娜丽莎的形体从观看者的位置拉向遥远的地方，从而使画中人物更富有审美的魅力。
达·芬奇认为人是最神圣的。人体是自然界中最美的形象。他曾反复多次地测量证明，人体各部分之间的比例都是整数比，因此人体呈现出最为和谐的美，称之为“神圣的比例”。他说：“谁不尊重生命，谁就不配享有生命。”
《蒙娜丽莎》正是他以一个真实的女性的微笑歌颂着人自身的美丽，呼唤着人性的觉醒，颂扬生命的可爱之处。体现了他的人生哲理。
《蒙娜丽莎》的右手被誉为是世界美术史上最美的一只手。尽管科学发达的现代摄影技术无比高超，但如果把这只手与现代摄影作品相比，人们仍可以看出这只手更有体积感，更有重量，更有生命力。几乎完全临空的中指指缝隙中，人们似乎能听到音乐的美妙，感觉到蒙娜丽莎那瞬间的愉快。现代摄影是很难记录下这种内在的神韵的。
16世纪初的许多画家往往把精力放在形体正确、轮廓严密、线条准确、细节清晰上，结果在他们笔下的形象往往缺乏生气。出现了僵化的“睡美人”，只有达·芬奇，才把生动性提到了更高的境界，并创造了众多充满活力的形象。
然而，自《蒙娜丽莎》问世以来，人们对之赞叹不已而又争论不休的，则是蒙娜丽莎的“神秘微笑”。究竟什么是蒙娜丽莎“神秘微笑”的原因？她微笑的含义是什么？有人说这是“魅惑的微笑”，有人说是“邪气的微笑”，有人则认为是不可理解的神秘的微笑，是一个永恒之谜。其实，从画面上看到的蒙娜丽莎的微笑，是一种心安理得的自信和乐观从容的气度。而这一点，正是那个经过漫长的中世纪的黑暗，人们正从基督教神学的重压下觉醒过来，去追求新生活的时代特征。画中的蒙娜丽莎，从微笑中不仅显示出她的温雅、高尚和愉快，也显示出对新世界和新生活的欢欣和喜悦。这里没有丝毫的怀疑和恐惧，没有中世纪画家笔下人物的呆板、僵冷和对世界充满恐惧的踪影。也不像中世纪画像中那种作为神的奴仆的毫无生机的人，蒙娜丽莎是一个充满着青春和生命力的有血有肉的形象。达·芬奇用他的“蒙娜丽莎”，展示了那个伟大时代的人们新的精神风貌，揭示了人们对新生活的向往、乐观与自信。同时，也表达了他对解脱神的枷锁后的人以及人的美的热情赞颂。蒙娜丽莎的微笑，使这一人物形象具有了无限深广的意境。无论是其自身的和谐的诗意，还是其深厚广博的社会学、历史学涵义，都达到了无与伦比的高度。从这一点来说，蒙娜丽莎的微笑也是一曲千古绝唱。在蒙娜丽莎的身上，理性的原则和高度的诗意，崇高的精神和生动的肉体，情感和理智、科学和艺术，都和谐而完美地统一于一身。这正是文艺复兴时期人的完整的形象。是人类历史进程中出现的一个全面发展的杰出范例。《蒙娜丽莎》表现了时代的巨大思想蕴含和艺术造诣的惊人深度，因而几个世纪以来，人们对它永恒的魅力怀有持续不减的热情。
达·芬奇画成这幅画后，一直带在身边，视为珍藏品。直到他死后，才为法兰西国王弗朗西斯一世所收藏。现在这幅画珍藏于巴黎卢浮宫博物馆。在达·芬奇画《蒙娜丽莎》的期间，他的父亲彼埃罗·达·芬奇于1504年7月7日去世了。彼埃罗先生活了80岁，可谓长乐长福，享尽天年。他身后有10个儿子和两个女儿。彼埃罗先生生前多次说过，他的非婚生长子列奥纳多·达·芬奇，同他的其他儿子一样，可以继承他的遗产。可是，等到彼埃罗先生去世时，达·芬奇的异母弟弟们宣布：他们的哥哥是父亲的私生子，对于遗产没有权利继承。
正当达·芬奇束手无策的时候，有个放重利的人，一个狡猾的犹太人，曾因他有得到遗产希望而借钱给他的，便向他提议购买他同弟弟们争夺的权利。达·芬奇虽然厌恶家务纠纷和诉讼带来数不清的烦恼，平时对这一类事情避之惟恐不及，但是那时他的经济景况如此枯窘，不得已答应了犹太人。于是开始了诉议，争300个弗罗财产，官司延续了六年之久。他的弟弟们利用一般人对于达·芬奇的不满，火上添油，攻击其不信上帝，在恺撒底下做事时出卖祖国，行巫术，挖掘死尸来解剖，亵渎基督教坟墓；他们也重提那25年前已经止息的关于他的反叛自然的罪孽的传闻，而且侮辱他的已经逝世的母亲卡德琳娜；并添油加醋，提出有关于达·芬奇同性恋的指控；更加卑鄙的是，散布流言蜚语，利用一般人对科学的无知或误解攻击达·芬奇的一切著作。
除了遗产继承上的纠纷，达·芬奇还有其他很多不愉快的事情。他与米开朗琪罗之间的误解越来越深。在佛罗伦萨市政会议厅展开的壁画竞赛就是比他年轻23岁的米开朗琪罗出来公开与他挑战的行为。而他们壁画的草图展出后，又在佛罗伦萨市民中引起争议。有人说《安加利之战》高于《卡西那之战》，有人则持相反的看法。事情发展的结果，竟导致有人在夜间拿出石头去投米开朗琪罗的“大卫像”。而米开朗琪罗则一口咬定这些流氓的所为是达·芬奇收买，并指使他们干的。这使达·芬奇有口难辩，十分难堪。此外，身为当时著名政治家的佛罗伦萨终身大执政的彼埃罗·索德里尼与达·芬奇也是话不投机。他经常暗示达·芬奇曾为斯福查和恺撒·波尔查绘过佛罗伦萨周围的军用地图，这无疑是有叛国嫌疑的。他希望达·芬奇能有一种忏悔的精神替他的政府服务。他还用讥讽的语调来评论达·芬奇的《安加利之战》。甚至在达·芬奇领出的一笔工作费用的款项上，他都认为是贪污行为。
故乡对于达·芬奇来说，已是非留之地也。他觉得难以在这里继续生活和工作下去。于是，经过米兰的法国总督查理·达·安波斯的请求，佛罗伦萨的执政们允许达·芬奇请三个月的假。在春天的时候，去米兰一行。同25年前一样，他又带着一种愉快的心情离开故乡佛罗伦萨，奔赴米兰。