病理组织中可有各种各样的色素沉积,其中有些来源于机体内,即内源性色素如黑色素、脂褐素、胆红素、含铁血黄素、疟色素等;有些来源于机体外,即外源性色素和无机物如文身的色素、钙、矽、石棉和铜等。
病理组织里最常见到的色素呈棕色或黑色。最主要的是酪氨酸的氧化和聚合物黑色素与不饱和脂质的氧化和聚合物脂褐素间的区别,两种色素都呈棕黑色无双折光性,且均为铁反应阴性。
脂褐素是一类成分各异的物质。通过上述两种或两种以上方法确定黑色素通常是可能的。黑色素漂白反应亦可漂白脂褐素。Warthln-Starry对鉴别黑色素有特异性。
黄色色素胆红素和橙色血质是血红蛋白的分解产物,其化学成分基本相同。橙色血质有时有双折光性。一般来说,这些色素可以通过Gmelin反应或Hall法等鉴别。
组织内无机物的染色方法还没有受到足够的重视。许多无机物水溶性强,不能在缓冲福尔马林固定组织中保存,也不能用含水染液染色。有些无机物虽然水溶性很低,但对不损坏组织的试剂又不发生反应,而能发生反应的试剂又会破坏组织。有些成分如骨、牙齿和病理性钙化中的磷灰石是完全不溶于水的,一般染色过程也适用。有些无机成分与蛋白质等有机物结合后可在福尔马林固定的组织内保存,其中一部分可被染色。鉴于扫描电镜X线分析技术的运用和发展,无机物的组织化学似乎已无更大发展前途。现在,一种新的无机物组化方法的特异性如何,常需经过这种技术的检验。
一、Warthin-Starry黑色素染色法(pH3.2)
1.固定10%中性缓冲福尔马林,勿用铬酸盐固定液。
2.切片石蜡,4~6微米。
3.试剂
1%柠檬酸液
柠檬酸1克
蒸馏水100毫升
灭菌蒸馏水
加酸水
灭菌蒸馏水1000毫升
加1%柠檬酸溶液使pH达到3.2。
1%硝酸银溶液(用于浸染)
硝酸银晶体1克
加酸水100毫升
预热水浴至43℃。1%硝酸银液注入染缸,置入水 浴。
2%硝酸银贮存液(用于显色)
硝酸银晶体2克
加酸水 100毫升
新鲜配制,盛于染缸内,置入54℃水浴30分钟,即可使用。
5%明胶贮存液(用于显色)
明胶 5克
加酸水 100毫升
新鲜配制,盛在染缸内,置入54℃水浴30分钟,即可使用。
0.15%对苯二酚贮存液(用于显色)
显影级对苯二酚 0.15克
加酸水 100毫升
新鲜配制,盛在染缸内,置入54℃水浴30分钟,即可使用。
分化液
加热的2%硝酸银贮存液1.5毫升
加热的5%明胶贮存液3.75毫升
加热的0.15%对苯二酚贮存液2毫升
在下述第三步结束前?熏按上列顺序用移液管移取上面三种液体入一小烧瓶或烧杯内,在加入对苯二酚液前彻底混匀硝酸银和明胶液,然后彻底混匀三种溶液。
核固红液(见第15章)
4.步骤
(1)脱蜡至蒸馏水洗;
(2)置入灭菌蒸馏水中;
(3)43℃下1%硝酸银液浸染45分钟。在此步结束前3~5分钟准备分化液;
(4)蒸馏水快速冲洗切片1次;
(5)将切片放在玻棒架上,用分化液淹没约8分钟;
(6)热水快速彻底洗;
(7)切片入蒸馏水;
(8)核固红复染5分钟;
(9)蒸馏水漂洗3次;
(10)95%酒精、纯酒精,二甲苯各2次,每次2分钟;
(11)树脂封固;
(12)弃去所有配制的分化液。
5.结果:
黑色素 黑色
核 粉红色
胞浆 黄色
二、黑色素色漂白法
1.固定10%中性缓冲福尔马林。
2.切片石蜡、冰冻或火棉胶,6~12微米。
3.试剂
0.25%高锰酸钾溶液
高锰酸钾 0.25克
蒸馏水 100毫升
5%草酸溶液
草酸 5克
蒸馏水100毫升
4.步骤
(1)脱蜡至蒸馏水洗;
(1)0.25%高锰酸钾液内5分钟或更久;
(3)蒸馏水仔细漂洗;
(4)5%草酸溶液内5秒钟或直至切片清晰;
(5)蒸馏水仔细漂洗;
(6)染色。
5.结果
黑色素和脂褐素消失
【附】切片时漂白法
(1)漂浮石蜡切片、火棉胶切片或冰冻切片在0.25%高锰酸钾溶液表面,轻轻地振荡并保持5分钟或稍久;
(2)一张一张地移出切片,用蒸馏水洗2次;
(3)漂浮切片在草酸溶液内,轻轻地振荡,直至切片透明;
(4)蒸馏水漂洗切片数次(每次换水)。石蜡和冰冻切片即可贴片,而火棉胶切片则保持在蒸馏水里直至染色;
(5)含明胶的水浴(42℃~56℃);
(6)彻底沥干;
(7)42℃~48℃烤片,过夜;
(8)石蜡切片脱蜡至蒸馏水洗,冰冻切片入蒸馏水。按需要进行染色。
结果
黑色素和脂褐素消失
三、Fontana-M8ssoll亲银颗粒和色素染色法
1.固定10%中性缓冲福尔马林。
2.切片石蜡,4~6微米。
3.试剂
10%硝酸银溶液(见第15章)
Fontana硝酸银贮存液
10%硝酸银95毫升
浓缩氢氧化铵一滴一滴地加至沉淀消失,10%硝酸银一滴一滴地加至溶液轻度混浊。放置过夜后使用。
Fontana硝酸银工作液
Fontana硝酸银贮存液 25毫升
蒸馏水75毫升
用时过滤。
1%氯化金贮存液 (见第15章)
氯化金工作液
1%氯化金贮存液 10毫升
蒸馏水40毫升
5%硫代硫酸钠液 (见第15章)
核固红液(见第15章)
4.步骤
(1)脱蜡至蒸馏水洗;
(2)Fontana硝酸银工作液,37℃烘箱中1小时或至切片呈亮棕色止。至45分钟时检查切片,因为烘箱温度可能
变化,如切片呈很亮的棕色即取出切片,冷却5分钟;
(3)蒸馏水漂洗3次;
(4)氯化金工作液调色10分钟;
(5)蒸馏水洗;
(6)5%硫代硫酸钠溶液5分钟;
(7)蒸馏水洗;
(8)核固红复染5分钟;
(9)蒸馏水彻底冲洗;
(10)95%酒精、纯酒精、二甲苯各2次,每次2分钟;
(11)树脂封固。
5.结果
亲银颗粒 黑色
黑色素 黑色
核和胞浆 粉红色
此法对黑色素无特异性,因为其他银还原物质也着色。
四、Churukian-Schenk嗜银颗粒染色法
1.固定10%中性缓冲福尔马林。
2.切片石蜡,4~6微米。
3.试剂
0.3%柠檬酸液
柠檬酸0.3克
蒸馏水100毫升
酸化水
蒸馏水500毫升
加0.3%柠檬酸使其pH值达到4或略高于4。
0.5%硝酸银液(浸染用)
硝酸银0.5克
酸化水100毫升
盛于染缸内,预热至43℃。
分化液
无水亚硫酸钠5克
对苯二酚1克
无菌水100毫升
盛于染缸内,预热至5℃。
核固红液(见第15章)
4.步骤
(1)准备两个水浴,分别预热至43℃和56℃;
(2)脱蜡至蒸馏水洗;
(3)酸化水内3分钟或更久;
(4)预热至43℃的0.5%硝酸银液内2分钟,连同染缸一起转入56℃水浴2小时(液体回收);
(5)蒸馏水淹没切片;
(6)预热至56℃的分化液内10分钟,回收液体;
(7)蒸馏水漂洗3次;
(8)自来水流水洗3分钟;
(9)蒸馏水漂洗3次;
(10)重入0.5%硝酸银液内10分钟;
(11)蒸馏水漂洗3次;
(12)预热的分化液内10分钟;
(13)蒸馏水漂洗3次;
(14)核固红液复染3分钟;
(15)蒸馏水漂洗数次;
(16)95%酒精、纯酒精、二甲苯各2次,每次2分钟;
(17)树脂封固。
5.结果
嗜银颗粒棕—黑色
核和胞浆红—粉红色
五、Perls铁染色法
1.固定10%中性缓冲福尔马林。
2.切片石蜡,4~8微米。
3.试剂
20%盐酸溶液
盐酸20毫升
蒸馏水80毫升
加酸入水。
10%铁氰化钾贮存液
铁氰化钾10克
蒸馏水100毫升
盐酸铁氰化钾工作液
等量的20%盐酸和10%铁氰化钾贮存液混合。临用前配制。
核固红液(见第21章)
4.步骤
(1)脱蜡至蒸馏水洗;
(2)新鲜配制的盐酸—铁氰化钾工作液内30分钟;
(3)蒸馏水漂洗;
(4)核固红液复染5分钟;
(5)自来水彻底洗涤2分钟;
(6)常规脱水透明;
(7)树脂封固。
5.结果
含铁血黄素、某些铁氧化物和铁盐蓝色
核和胞浆 粉红色—红色
六、Mallory氏铁染色法
1.固定10%中性缓冲福尔马林。
2.切片石蜡,4~6微米。
3.试剂
5%铁氰化钾贮存液 (见第15章)
5%盐酸贮存液 (见第15章)
铁氰化钾—盐酸工作液
5%铁氰化钾贮存液 50毫升
5%盐酸贮存液 50毫升
核固红液 (见第15章)
4.步骤
(1)脱蜡至蒸馏水洗;
(2)铁氰化钾—盐酸工作液内10分钟,切勿与任何金属接触;
(3)蒸馏水冲洗;
(4)核固红复染5分钟;
(5)自来水彻底洗涤2分钟;
(6)常规脱水透明;
(7)树脂封固。
5.结果
含铁血黄素、某些铁氧化物和铁盐 蓝色
核和胞浆粉红色—红色
七、Von Kossa无机盐染色法
1.固定10%中性缓冲福尔马林。
2.切片石蜡,4~8微米。
3.试剂
5%硝酸银溶液 (见第15章)
照片显影液
显影液(黑白胶片和照片用)50毫升
蒸馏水50毫升
5%硫代硫酸钠液 (见第15章)
核固红液(见第15章)
4.步骤
(1)脱蜡至蒸馏水洗;
(2)5%硝酸银液1小时;
(3)蒸馏水反复振洗4次(每次换水);
(4)显影液2分钟;
(5)蒸馏水换洗2次;
(6)5%硫代硫酸钠溶液5分钟;
(7)自来水洗2分钟;
(8)核固红复染5分钟;
(9)自来水彻底洗2分钟;
(10)常规脱水透明;
(11)树脂封固。
5.结果
骨和无机盐(包括钙、铁及其他金属形成的磷酸盐、碳酸盐和草酸盐)黑色沉淀
尿酸和尿酸盐 可显假阳性反应(黑色)
核和胞浆 粉红色—红色
八、钙质茜素红S染色法
1.固定10%中性缓冲福尔马林。
2.切片石蜡,4~6微米。
3.试剂
茜素红S液
茜素红S 2克
蒸馏水100毫升
滴加氢氧化铵至pH4.1~4.3。不断搅动。
丙酮
丙酮二甲苯液
丙酮50毫升
二甲苯50毫升
4.步骤
(1)脱蜡至蒸馏水洗;
(2)茜素红S液30秒钟至5分钟;
(3)镜检。橙红色出现时终止染色;
(4)不复染;
(5)快速通过丙酮、丙酮二甲苯、二甲苯进行脱水透明;
(6)树脂封固。
5.结果
多数钙盐 有双折光性的红色沉淀物
草酸钙 无反应
九、铜若丹明染色法
1.固定10%中性缓冲福尔马林。
2.切片石蜡,4~6微米。
3.试剂
0.2%若丹明贮存液
5-(P-二甲氨基苯亚甲基)若丹明0.2克
纯酒精 100毫升
pH8.0~8.3醋酸缓冲液
40%甲醛5毫升
醋酸钠 20克
蒸馏水1000毫升
若丹明工作液
0.2%若丹明贮存液3毫升
pH8.0~8.3醋酸缓冲液50毫升
Mayer氏苏木素液
4.步骤
(1)脱蜡至蒸馏水洗;
(2)若丹明工作液,37℃18小时;
(3)pH8.0~8.3醋酸缓冲液换洗3次;
(4)Mayer氏苏木素溶液复染10分钟;
(5)pH8.0~8.3醋酸缓冲液换洗3次;
(6)常规脱水,透明;
(7)树脂封固。
5.结果
铜红色
核蓝色