栽培种的培养基和原种相同，不同之处是装料量比原种少，料装至瓶深1／4～1／3，即4～5厘米高，以使瓶内有足够氧气，促进银耳菌丝较快生长。
接种前，先将用纯种分离制作原种和用混合分离法制作母种的菌种瓶内已形成的子实体原基，或者长出部分耳片的子实体挖去，并用接种铲把残留耳基、培养基表面老菌丝和黑疤（点）彻底清除干净，再把上层2厘米左右的培养基和银耳菌丝扭结一起的硬块层挖松、捣碎、拌匀（捣得越碎越好），离瓶底3～4厘米培养基中含银耳纯白菌丝少，不要挖出来用。最后用接种匙挑取一小匙菌种碎粒接到已灭菌过栽培种培养基上。一般一瓶原种可接栽培种40瓶左右，最好接20瓶。接种后，按原种培养方法进行管理，在22～24℃下，经3天培养，培养基表面布满灰白色香灰菌丝，并出现少量白毛团。5天后香灰菌丝吃料i厘米左右，培养基表面出现较多白毛团。8—10天，香灰菌丝长培养基3～4厘米，培养基表面出现很多白毛团，有的白毛团分泌出无色或淡黄色水珠，种瓶内壁上有淡墨色花纹，即成栽培种（三级种）。栽培种的菌龄不能太短，菌龄太短银耳纯白菌丝只长料面很薄一层，拌种时，种瓶内银耳纯白菌丝少，出耳不均匀，甚至出现空穴不长银耳子实体。