覆土材料中可能潜伏着许多病原菌及害虫，所以覆土前必须对覆土材料进行消毒，以最大限度地降低覆土材料中病原菌和害虫的含量，减轻或杜绝鸡腿菇栽培的病虫危害。常用的消毒方法有甲醛消毒法、曝晒消毒法、蒸汽消毒法和漂白粉消毒法等。
（1）甲醛消毒法。每立方米土粒用0．5千克40％甲醛溶液（福尔马林），兑水5～10升，均匀喷洒在土粒上，然后做堆并盖上薄膜；或将土粒做堆，堆顶中再做一凹坑，坑内置一容器，将高锰酸钾倒进容器，并注入少量水溶解，然后按每立方米土粒加入0．5千克福尔马林的量加入甲醛，随即盖上薄膜，使甲醛在膜内汽化。无论是喷雾消毒还是汽化消毒，施药后土堆都必须迅速用较厚的塑料薄膜覆盖，薄膜四周要用湿泥糊实压严，密闭熏蒸24～48小时。然后揭去薄膜，扒开土堆并翻动土粒，等土粒上残留的甲醛气味消失后（约3~5天）才可覆盖菌床，否则会产生药害，影响土层菌丝的正常生长，推迟出菇。
（2）曝晒消毒法。将制粒后的覆土材料铺在清洁、干燥、坚硬的地面上，最好是水泥地面，经阳光曝晒3～5天，每天翻动1~2次，也可基本达到消毒效果。如果用透明塑料薄膜严密覆盖土粒进行曝晒，在烈日下膜内温度可达50℃以上，效果更好。这种消毒法既简便节约，又安全有效。
（3）蒸汽消毒法。将晒干土粒置于密闭的环境内（如密闭的菇房等），利用制种灭菌设备或后发酵湿热加温设备，通入60℃～65℃的热蒸汽，保持3~4小时，或70℃~75℃的热蒸汽保持1～2小时。消毒后要让土壤冷却24小时，散去土粒表面水分，即可使用。
采用以上方法对覆土材料消毒时，通常结合喷洒杀虫剂和杀螨剂，以兼治土壤中的害虫、害螨。常用的药剂有80％的敌敌畏800～1000倍液，20％的二嗪农500倍液，20％的三氯杀螨砜800～1000倍液等。同时，拌入2％~3％的石灰粉，既调节了土壤的pH值，使之成弱碱性，又可杀死土壤中的线虫。如果栽培面积较小，或土壤较干净，可以喷洒0．1％的多菌灵溶液和0．1％的敌敌畏溶液，并加入2％～3％的石灰粉，翻拌均匀后盖膜闷堆1～2天，也能达到消毒目的。
消过毒的土壤应放在严格消毒的房间，不让蝇虫及畜禽靠近，以防二次感染。处理好的土壤后应立即使用；若要放置，一般不超过5天。