液体培养基进行高压蒸汽灭菌时，一般压力为0.103兆帕，温度121.3℃，灭菌30分。固体培养基进行高压蒸汽灭菌时，压力为0.14兆帕，温度129℃，灭菌1.5～2.5小时。
高压蒸汽灭菌时，必须严格按操作规程操作，以免发生事故。其具体使用方法和步骤是：①打开进水阀，加水至标记水位高度，关闭阀门；②将灭菌物放在灭菌锅内，不宜装得过密；③盖好锅盖，上下对齐，以对角线方式拧紧螺丝，使锅密封；④打开排气口，点火加热，待冷空气排尽后，关闭排气口，让其升温，当压力表上显示出所需压力时，开始计算灭菌时间，并调节火力，维持压力至所需时间；⑤达到规定灭菌时间后熄火，让其自然降温冷却；⑥待压力指示降至零时，打开锅盖，取出灭菌物，并打开放水阀和冷凝水出口，放尽锅内余水。