1499年7月底，法兰西国王路易十二派遣他的大军，越过阿尔卑斯山，向伦巴底入侵。9月，米兰被法军占领。斯福查公爵逃出米兰。次年初，米兰市民起义，赶走了法国人。斯福查公爵于1500年2月又回到米兰。但好景不长，不久路易十二的大军又一次兵临城下。两军对垒，还未开战，斯福查公爵的军队便投降了。公爵化装成修士打算逃跑，但被人出卖，成了法王路易十二的俘虏。八年之后，死于监禁的塔中。
达·芬奇在1499年底离开米兰城，去郊外的瓦卜里奥村他的朋友家避难。他在开凿马特散那运河期间到过这里，并非常喜欢这个美丽的地方。
瓦卜里奥村位于阿达河陡峭的左岸。阿达河的急流从山上沿黄砂石的河床奔腾而下，在这里受到石岩的阻挡，发出海涛澎湃一般的咆哮声。在粗犷奔放的阿达河旁边，马特散那运河像镜子一般，平静地穿过伦巴底平原。在村边的最高的小山坡上，可俯瞰整个翠绿的伦巴底平原。河岸是肥美的牧场，成群的牛和羊在绿色的地毯上，田园里的小麦和裸麦翻卷着绿浪，其间点缀着梨、杏、苹果和樱桃等各种果树。再向北边看，远山连绵，阿尔卑斯山山脉像一道屏障，矗立在平原和蓝天之间。傍晚，可以看见雪山顶上闪烁的金黄的玫瑰色的夕阳余晖。达·芬奇在这个风光绮丽的山村，仿佛又回到童年时代的芬奇镇。他常常陶醉在奇妙美丽的大自然中乐而忘返。
初春时节，万木复苏。达·芬奇整天在主人别墅园圃里面，或是在附近的树林中，观察绿色生命如何觉醒过来。他观察一株树、一朵花的独特的个性。这样，在他的笔下，每一种花草都如同一幅肖像，表现了它本身的绝无仅有的特殊性。他发现，春天的时候，树木的液汁怎样从树木的内绿皮和外皮之间凝集起来，使外皮松懈，发生皱襞。去年皱襞之中发生新的更深的皱襞，这样使树干粗大起来。倘若树的枝条被人砍下或外皮被损伤。树木自救的本能将倾注比其他各处更多的流汗于此处，使伤处痊愈并结成一片更厚的外皮。液汁的流注是很有力量的，有时竟停留不住，溢出伤处外面，结成泡沫似的瘿疤。他还发现一些为常人视而不见的更精微的植物生长规律：枝从阴影中伸向太阳，泉流从地下涓涓涌出，蜜蜂从冬眠中醒来，用力钻进含苞未放的花蕊。达·芬奇看到，大自然一切都是充满生命的。宇宙就是大的有机体，而人类机体也就是小的宇宙。这个古希腊时代哲人提出的宇宙观，被他更深切地体验到了。
他还发现自然现象中许多谜一般的共性：他研究虹霓现象时，发觉飞禽羽毛、止水、朽树根、宝石、飘浮在水面上的油脂和浑浊不明的旧玻璃上面，都有与虹霓同样的景色。树叶上和窗户玻璃上凝结的薄霜，也与真实的叶、花、草具有相似的形态。与此同时，他还常在夜间站在主人的房顶上，观看星宿的运行，记录天象的变化，继续进行他的天文学研究。在天文学领域中，通过他自己长期的观察证实了哥白尼的”日心说”相似的结论——太阳是不动的。这在当时是大逆不道的理论。
他又是个杰出的气象学家。在观察大气层时，发现空气有可见的厚度，并因此创造了绘画中的“空气远近法”——物体愈远就愈深地隐入到淡蓝色的气雾之中，这就类似我们正面观察洁净的玻璃，往往以为它总是无色透明的，但是，如果从侧面观察时，就会发现它是淡绿色的。无色的玻璃如加厚也会呈现淡绿色，所以，万里无云的晴空是湛蓝色的。远山的剪影也是蓝色。如果这远山上长满了红叶，那就应该是淡红色加上淡蓝色成了淡紫色，依此类推，得出山上的树叶更有橙、黄、灰等色，天上的云霞又有金、红、紫、灰等色，当它们互相辉映时，人们就会发现自然界的颜色是五彩缤纷的、千变万化的了。
达·芬奇也曾涉足生物和物理领域。他从鸟儿的飞翔联想到，空气应该像水一样具有一定的浮力，他根据这个道理设计出了很多飞行器。他像地质学家一样地观察岩石，又以植物学家的眼光去研究树木，并画出过精细的岩石和植物标本图解。在达·芬奇的笔下，这些图解都是带有很高的艺术性。
随着米兰被法国军队的二次占领，米兰的近郊也渐渐不能安宁了。法国人、德国雇佣兵、威尼斯人开始劫掠村民，小帮土匪也不断出现。达·芬奇在瓦卜里奥村住不下去了。于是他启程前往威尼斯。途经曼都亚时，为曼都亚的伯爵夫人伊莎贝拉·达·埃斯蒂画了幅素描肖像。伊莎贝拉是米兰公爵斯福查夫人贝特丽采的姐姐，她曾多次写信要达·芬奇给她画肖像和其他宗教题材的作品。不久，达·芬奇从威尼斯回到故乡佛罗伦萨。
此时的达·芬奇与18年前离开佛罗伦萨时相比，已经大不一样了。他已近“知天命”之年，当年的少年英姿已经退去，取而代之的是成熟的大艺术家的丰采。他在沉思的时候，颦蹙的眉毛下两颗浅蓝色的眼睛，闪着锐利而冷峻的目光。这种目光在说话的时候，立即变换为和悦的情意，金黄而浓密的卷发下，昔日曾是具有女性一般温柔美丽的面孔，现在长出了金黄色的长胡子，添上岁月刻下的皱纹，变成了一幅庄严的相貌。他的身体仍然魁梧矫健，声音高亢悦耳。回来不久，达·芬奇就接到佛罗伦萨的圣安伦齐亚塔修道院的计划。他很快作出了《圣安娜》的画稿。这是一幅描绘圣安娜、玛利亚、耶稣和施洗约翰相聚玩乐的画。画面的背景是一个幽静的山中牧场，玛利亚和耶稣分别坐在圣安娜的腿上。圣安娜怀抱着耶稣，面对着玛利亚。玛利亚似乎正注视着与耶稣玩耍的约翰。圣母女脸上露出温柔、幸福的微笑。耶稣幼小的形象，更多显露出天真、顽皮的神态。小约翰则更是一副山村孩子的模样。整个画面表现出一种天伦之乐和纯洁愉快的情调，人物间表现出相互交融的愉快情感。画面运用了明暗转移法，使画面从明到暗连续过渡，产生薄雾和月光一样的朦胧效果，增加了画面的抒情气氛。画好之后，《圣安娜》被拿去展出，立即轰动全城。据说，当时佛罗伦萨的市民，都像过节似的成群结队前来观展。
不过，达·芬奇没有陶醉在故乡人民给他的盛赞之中。他趁机探访了童年时代的居住地和诞生地芬奇镇，见到了他的一些亲属和故旧，并在当年他玩耍过的山间和草地上重温旧梦。故居破败的房屋，安基亚诺村小酒店的废墟，还有山坡上的荒凉和寂静。把达·芬奇从沉沉的记忆中唤回到现实。他早就打算离开佛罗伦萨去罗曼雅，在瓦伦丁公爵恺撒·波尔查的宫中任职。此时，他很快就下了决心。
恺撒·波尔查是教皇亚历山大六世（1431-1503）与其情妇诺札·贾旦妮所生之子。此时，他利用教皇的权势和法兰西国王的庇护，在意大利攻城略地，横行一时。他把达·芬奇奉为上宾，是因为他需要达·芬奇这样的大建筑师和大工程师为他服务。他曾命令属下的一切总督、司令、将军、头领、官吏、兵士和臣民，对达·芬奇必须以礼相待，任他及其随员自由通过，准许他视察、检查军事要塞和堡塞的一切事物，并毫不迟疑地提供他所需人员，与他积极合作。
达·芬奇受恺撒·波尔查的委任，便在他的宫廷里操办起土木工程事业。他为恺撒的军队在那波伦拿要塞废墟上建筑了宽敞的营地，并开辟了亚德里亚海西岸最优良的海岸采塞那港，还开挖了一条运河与采塞那城相通。他在彭比诺建筑坚固要塞，还发明新的武器和装备，测绘地图。此外，他还陪伴公爵各处出征。他的生活几乎是戎马倥偬的军事生活，他似乎是全身心投入这些筑寨、开山、挖河等工程事务中。其实，达·芬奇从来没有停止过他那艺术家、科学家的思维和观察。他记录了采塞那农民怎样用葡萄藤缠绕着果树，塞那人怎样安排杠杆去搬运大教堂的钟，黎弥尼城的喷泉落水如何发出罕有的音乐之声，等等。他还观察到，亚平宁山下、罗曼雅境内的牧童们怎样将号角上粗大的一端钻些深孔，以加强号角的声音，这样有回声的号角吹响之后，连最远山上的羊群都能听见。当然，他也批评罗曼雅人的四轮车，前面两个轮小，后面两个轮大，是个愚蠢结构。因为照他的物理学法则，全车的重量都是压在前轮之上的。这个车子的构造违反他的机械学法则。
正当恺撒·波尔查巧取豪夺，扩大疆域，觉得很快就要统一意大利的得意时候，他的父亲，教皇亚历山大六世在1503年8月18日带着无限的悔恨一命呜呼。恺撒·波查尔的命运从此急转直下，灾难之星一直照在他的头顶上。在教皇一病不起的时候，恺撒本人也染上了重病。他的那些仇敌们，一得知教皇死去和恺撒病倒的消息后，便联合起来向他进攻。他数年来费尽心机、艰苦征战获得的江山，一个一个地陷落了。功败垂成，恺撒一蹶不振。随着他的功名和事业的衰败，他的生命不久也走到了尽头。1507年冬，他在一场混战中死于刀剑之下。
此时的达·芬奇，在恺撒的宫中赋闲。他有时画点画，有时又进行各种各样的机器设计，记得有一次达·芬奇正在画一幅大型壁画时，忽然心血来潮，想要制造一个做米兰香肠的机器，于是那些未曾画好的壁画就丢下了。直到这香肠机器制造成功，他才有功夫去画。有时候那张最好的圣母像，也被他搁到一边去，因为他要发明一种自动烧烤器，使烧烤阉鸡和小猪时，各部分都烤得均匀。接着又是他的伟大发明：他发明了从鸡粪里提炼洗濯碱料的方法。像抽水机、捻丝机、锯石机、辊铁机、织布机、剪布机和制陶机等，还包括巨大的起重机。他完全不去理会恺撒及其周围发生的事情。
在达·芬奇的房间内，满地都是些机器以及天文学、物理学、化学、机械学、解剖学等所用的仪器。车轮、杠杆、弹簧、螺旋、棍棒、弯管、唧筒以及其他机器零件，铜的、钢的、铁的和玻璃的——乱七八糟堆在那里，好像怪物或巨虫的肢体。
此外，还有一口潜水钟，一个闪烁有光的水晶球，当作放大的眼表模型以及光学上研究之用，一个马的骨架，一个空心的鳄鱼，一个人胎用酒精浸在玻璃瓶子内，像一条灰白色的大毛虫，一双船样的尖头鞋子为在水上行走之用，一个伶俐而忧郁地微笑着的黏土制的少女头或天使头，显然是从隔壁工场错放到这房里来的。房内还有一个熔炉，连着一架风箱，炉底黑口有火炭可以燃烧取火。这也是他的杰作。
1503年秋，达·芬奇接到佛罗伦萨共和国终身大执政彼埃罗·索德里尼的聘请，聘他为军事工程师，在比萨军营里制造围城战具。这样，达·芬奇便于当年又回到故乡佛罗伦萨。