母种生产主要包括培养基制备、纯种分离或转管扩大、培养等环节。常用的母种培养基是PDA培养基，其配方为：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，琼脂18～20克，水1000毫升。PDA培养基的制作方法如下：
（1）培养基制作。将马铃薯洗净、去皮、挖去芽眼及变青绿部分，称取200克，切成长、宽各2厘米，厚3毫米左右的薄片，在1200毫升水煮沸10～15分钟，然后用4～6层纱布过滤，倒掉残渣并洗净铝锅。将滤液倒入锅内，加清水补足1000毫升，同时放入琼脂并重新开始加热，最好小火加热，不断搅拌至琼脂完全溶化，再用纱布过滤一次，补水至1000毫升。最后依次将称好的葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素加入，继续加热并搅拌至全部溶化，停止加热。如果要加入蛋白胨需将蛋白胨用冷水溶化后加入，可以避免蛋白胨因结块而分散不均。
（2）分装试管。左手持3～4支试管，管口朝上，令其下端整齐，上移试管至漏斗软管，插入试管内约3厘米。右手捏紧软管止流夹，使培养基液体流入试管，准确掌握液体培养基装入试管的数量，直立试管时液体高度约为试管长度的1／5即可。此时松开止流夹液体停止流入。将试管下移离开软管，再分装第二支试管，周而复始，直至全部装完。分装试管要求速度快，尤其在低温季节操作，以防止培养基凝固。装量要准确，因为装量偏多摆成的斜面变短，又浪费培养基；装量偏少则使摆成的斜面太薄，营养少，菌丝难以正常生长。注意避免将培养基黏附到试管管口，以免造成粘着棉塞现象，还易引起棉塞上滋生杂菌，给菌种质量留下隐患。
（3）棉塞制作。试管分装好后，要塞好棉塞。棉塞要用普通棉花，不能用脱脂棉。棉塞制作方法多样，现介绍一种常用制作方法：取棉花适量，做成一均匀片（步骤1），从一边向里折叠，使之成为一条整齐的边（步骤2）。再将相邻的另一边向里折叠，使第二边与和第一边成直角（步骤3）。顺着第二边将棉花卷紧（步骤4），成为柱形，末端的棉絮自然平贴在棉柱上（步骤5）。将毛茬的一边折转平贴在棉柱上（步骤6），将此端塞入试管口。棉塞的2／3塞入试管中，管外留1／3（步骤7）。
（4）试管包扎。试管塞好棉塞后，取7支同样规格的试管，用牛皮纸或双层报纸将棉塞端包住，并向下延伸到试管中部，用粗棉线将其扎成一把。
（5）培养基灭菌。母种培养基多采用手提式高压灭菌锅进行灭菌，灭菌操作过程如下：①检查高压蒸汽灭菌锅的压力表及各部位是否灵活、可靠，尤其注意检查安全阀是否发生堵塞或锈死。②在锅内加入约3千克自来水，加至支架下缘。③将捆好的培养基棉塞向上垂直放入灭菌筐（桶）。④将锅盖上垂下的排气管插入套筒内壁的导气管中，然后用双手同时用力，分别将对角线方向的两个螺丝拧紧。⑤排冷空气。封盖后关闭排气阀开始加热，当加热至压力达0.05兆帕时，打开排气阀，排尽冷空气，待压力降至零后，即可关闭排气阀。最好依上法排两次。继续加热，当压力升至0.11兆帕时，开始计时，在0.11～0.14兆帕压力下保持30分钟，停止加热，使其自行冷却降压至零。打开排气阀，再将锅门打开一条10厘米左右的缝隙，利用锅体余热将棉塞烘干。如果不进行棉塞烘干的程序，棉塞潮湿易滋生霉菌。
（6）摆放斜面。观察到报纸干燥后，打开锅盖，当培养基温度降到60℃左右时及时取出摆放斜面。在桌上放置1厘米高的小木条，将试管斜放其上，摆成斜面。注意培养基要盖住试管底，斜面长度应以试管长度的1／2左右为好，最多不超过试管长度的3／4。当试管内培养基完全凝固后收起备用。制备好的培养基应放置在通风干燥处保存。
如果温度很高时就摆放斜面，培养基凝固后表面会出现较多的冷凝水，不利菌丝生长。在摆放好斜面后，用厚实的棉布覆盖住培养基，使培养基缓慢降温冷却，也可减少冷凝水出现。
（7）无菌检查。随机抽取几支试管放入37℃左右恒温箱中培养2～3天，若无杂菌生长便可放心使用。
（8）灭菌锅的维护。灭菌结束后，应趁热将锅内余水倒掉，当锅内壁干燥后盖好锅盖，将表面擦拭干净后妥善保存。