李时珍以唐慎微的《证类本草》为蓝本，根据自己的分析，按药物的名称、形状、产地、功用等项目编写，将名家说法罗列进去，加以比较，他一边着手书本考证，一边进行医疗实践，实践经验帮助他解决了不少难题。但是，工作越深入，难题越多，他发现各种本草书中对药物的名称、形状、产地、功用等记载往往写不清楚，有的记载相互不一致，甚至相互矛盾。
书中有解释，但是插图少，语句含糊，不能让人一目了然。
工作开展后，碰到的困难越来越多，他的心情越来越急。
李言闻看出儿子的心思，就对他说：“编一部《本草》，要把全国出产的药物都重新查访过”。“历代医书的作者中，许多人就是没有对药物进行一番实际调查，而是抄来抄去纸上猜度，所以闹出许多分歧和笑话。”
李言闻又鼓励儿子说：“你不是写过《蕲蛇传》吗？回忆一下是怎样写出来的呢？”
李时珍当然不会忘记自己胆战心惊地观察龙峰山上的白花蛇那段经历。
为了写好《本草纲目》，并使这本书具有真知灼见，真正拥有实际价值，李时珍决定自己亲自上山，遍采药品，在实践上增加自己的知识和能力。
于是，他先把要查访的药物开列名目，先找本地出产的，再找不容易寻到的；自己找不到，就向当地人请教。他先在蕲州周围查访，这里不少人认识他。他为人谦虚，又不耻下问，不论是种田的、捕鱼的、砍柴的、打猎的都要请教。人们知道他的意图后，都乐意为他提供情况，甚至和他一起去寻找可供制药的动植物和矿物。
一天下午，李时珍身背药箱走进一个山谷，眼前忽然一亮，他发现满山遍野开着一种白色的山花。这种草，茎直立，圆滑而绿，叶子很像茄子叶，花开白色，喇叭筒状，很像牵牛花，果实圆而有芒刺，中间有许多细小的种子。他急忙向路边的一位樵夫打听，得知这花叫曼陀罗花，俗称“洋金花”。
据说，有些人曾用它的花酿酒喝，或者把它结的种子用酒冲服，结果，使人相当长时间里手舞足蹈，狂笑不止，可是他自己笑了还不知道，还觉得恍恍惚惚，飘飘欲仙，挺舒服的。
李时珍听了以后，心中一动，他知道这些症状说明这种东西有麻醉作用。
他还知道早在东汉时期名医华佗就创造过“麻沸散”，用来进行全身麻醉。
但是麻沸散到了明朝早已经失传。他在想，莫非东汉名医“华佗”失传的“麻沸散”是用洋金花做原料的？
为了验证曼陀罗的麻醉作用，李时珍亲自采来了一捆曼陀罗花，在通风处摊开阴干，然后将其研成细粉。经过反复试验，发现这种花果然具有麻醉作用。李时珍后来给一个病人“割疮灸火”以前，就用曼陀罗花末与火麻子花末各一半，给病人用热酒调服3钱，然后病人不久就“昏昏如醉”，失去了知觉。这时再施行手术，病人就不会有痛苦难耐的感觉了。
今天，我国医务人员通过大量临床验证，充分证实了李时珍的实验结果是十分正确的，重新发掘了中药麻醉这一宝贵的祖国医学遗产。以曼陀罗为主的中药麻醉，安全、有效，现在已经广泛地应用于外科临床手术中。
初次实地考察竟揭示了失传千年的华佗“麻沸散”的秘密，这是多么大的收获啊，李时珍受到了鼓舞。他更乐意不耻下问，拜当地农民、渔民、樵夫、猎户、药农为师了。人们也乐意帮助这位名医，把捕获的鸟兽、采摘的药草，送上门来供他研究。
许多“本草”书里提到过“芸薹（tái）”，但是它究竟是一种什么药，却没有写明白，名家的注释也不清楚。李时珍到山中寻找也没有找到，便访问种菜人，仔细地观察了这种植物后，才知道它的俗名叫油菜，头一年下种，第二年开花，种子可以榨油，叶子似白菜等等，找到了这种事实上人们常见到的药材。
由于李时珍不耻下问，使人获益匪浅。他常想：豺、狼、虎、豹能否用来制药呢？李时珍向猎人请教。猎人告诉他说：虎血可以壮神强志，是一个好东西。一位专治蛇毒的能手告诉李时珍说，各种各样的蛇，多到上百种，专门医治蛇毒的草药有80多种。李时珍马上把这些经验和草药记录下来。
有位药农带李时珍去挖茯苓（fú líng），药农看到松树根上有弯弯曲曲、像丝一样的东西，就向下挖去，结果挖出一颗褐色的大茯苓。药农还告诉李时珍，这东西制成药，可以利尿。
一次，有一个卖药的，见李时珍在寻访草药，就从药袋里取出许多药，向他介绍说：“这是常山，可以治疟疾；这是麻黄，可以治喘病；这是黄连，可以治痢疾；这是三七，可以用来止血……”
提到三七，李时珍记得这种药在历代本草都没有提到，于是李时珍进一步采访四方，研究三七这种药。
三七，又名金不换，是一种贵重药品。李时珍发现三七是军中的金疮要药。该药生长于广西南丹诸州番峒深山中，是近几年才发现的药物。李时珍在行医中发现三七治疗跌打损伤的功效很突出，所以他考察了三七的产地、形态特征、气味、主治、用法，将它收入《本草纲目》中，并指出三七能治一切血病，尤其对于出血和淤血具有显著的效果。同时，他把《濒湖集简方》中八个三七用方编入［附方］中。他说：三七根气味“甘、微苦，温，无毒。”
有人讲三七又名山漆，是由于它能愈合刀伤创口像漆沾东西一样，故而得名，李时珍认为它很有道理。这种药只要把它嚼烂，敷在伤口上，出血马上就能停止，青肿也会随即消散。
《本草纲目》行世以后，李时珍的这一重大发现迅速得到推广，三七被医生们普遍采用，广泛用于治疗各种血症。“云南白药”的主要用药就是三七。而现在，三七更广泛地应用于战伤救护和外伤科、妇科、内科等多种疾病的治疗，近年来，发展为心血管病的常用药。三七这一珍贵药物的应用价值和经济价值已经越来越大。这些，都应当有李时珍的一份功劳。
李时珍带着徒弟庞宪和儿子建元，从蕲州出发，历尽风霜，长途跋涉，进行实地考察。许多药物蕲州一带找不到，就去外地找，南方不生长，就到北方采。
第一次查访花了他整整三年的时间。李时珍屋里放满了各种各样的动植物标本，挂满了绘有鸟、兽、虫、草的图画，连他的院子里，也种着名目繁多的药草。
在他38岁那年，他到了楚王府，后来又到了京都太医院。在那里，他没有追随当时的风气，讨好皇家，炼丹随和。而是一面争取国家对他编修“本草”这一工作的支持，一面饱览古代医学典籍，研究在民间很少见到的名贵药材和进口药材。这使他大开眼界，帮助他积累了更多的知识。
当时的朝廷，可以花费巨资炼丹以求长生不老，却不愿拿出一点点资金支助李时珍作非常有价值的实际工作。
李时珍知道一切都需依靠自己去成就这番艰难的事业。于是他任职一年后，便弃官回乡了，决定集中精力实现宏愿。
在李时珍南归途中，他念念不忘本草，随时为重修本草收集材料。他看见北方的车夫常常带着一种叫旋花的粉色小花，就问他们为什么？车夫告诉他，这是“暮归煎汤”饮用的。因为他们是干力气活的，这草每晚煎汤饮下，可以舒筋活血，补气长力。李时珍从车夫身上找到了旋花的效用，并收入《本草纲目》。
回到家乡，李时珍一面行医，一面正式编修《本草纲目》，由于经过实地查访，又到京都开阔了眼界，因此工作开始进行得很顺利。几年后，李时珍又发现了许多不很清楚的地方，于是，明世宗嘉靖四十四年（1565 年），已经四十七岁的李时珍，又开始了第二次外出查访。
登山爬岭，对于已四十七岁的老人来说，实在是很辛苦，但是一想到许多病人还在受病痛的煎熬，许多药局还沿袭着旧本草的错误，他便又抖擞精神出发了。
第二次外出查访，费去了四五年时间，他作了多次远程旅行，足迹遍及长江南北。到过湖南、湖北、江西、广东、安徽、江苏、河南等地。他们风餐露宿，身上带着一点干粮，饿了就啃一口干粮，渴了就捧一捧山水，摘一点野果子。无论山有多高，路有多险，丛林有多深，危险有多大，哪儿盛产药材，他们就往哪儿走。困了就席地而卧，采来了药便小心地晾晒，精心保存，这种艰辛的披星戴月的生活，没有使这位50 多岁的老人屈服，相反，却使他相信，只要努力，没有达不到的目标。
经过这次查访，李时珍又找到许多药物，并搜集了许多民间单方和书籍文献，这才回家埋下头来编修《本草纲目》。
他计划编修的这部书，要求图文并茂，这就需要制作许多幅药物形态图。
再加上把手头有几百万字的笔记，外出查访的资料，整理成条理分明的一部药典，真不是一件容易的事。
为尽快把这部巨著编修出来，李时珍白天除了行医外，利用一切时机伏案工作，没有一刻的轻松。同时，他还动员全家人一齐动手：有的抄写、有的绘图、有的校对。到了夜晚，李时珍立刻翻阅笔记，整理查对，为第二天的工作做好一切准备。日以继夜，夜以继日，李时珍所有的心思都放在医学上。繁重的工作使一个健康年轻的人都深感疲倦不堪，而他却仍然坚持着，从不放松一个细节。是他对事业的热爱和那份责任心促使他付出了远远超过他当时年龄的人所能付出的精力。
一稿完成，又经过三次修改。大约在明神宗万历六年（1578 年），这部凝结着李时珍一生心血、汇集和总结了古今药典精华和广大劳动人民药物知识的药物学巨著《本草纲目》，终于完稿了。30 年左右的辛苦劳动，李时珍送给人类一份功在当代，利在千秋的礼物《本草纲目》。
除了这部巨著之外，他还写过《濒湖脉学》、《奇经八脉考》、《食物本草》、《集简方》、《蕲蛇传》、《五脏图论》、《命门考》、《命门三焦客难》、《濒湖医案》等书，为祖国的医药事业做出了不可磨灭的贡献。
由于长期辛劳的工作，严重地损害了李时珍的身体健康。书稿完成以后，要把它传到世上，并不容易。李时珍拖着孱（chán）弱的身体，奔走了好几年，一直没有结果。而几十年编撰《本草纲目》已经使他耗费了所有家财，没有能力掏钱请人刻字印行。直到明神宗万历十八年（1590 年）左右，南京一个出版商才答应出钱刻印。
书稿开始刻印的第二年，李时珍病势加重，他被困在病榻上，日日惦记着这部书的出版。直到1593 年初秋，这位一生为解除别人的痛苦而生活、为别人流尽最后一滴汗的“医中之圣”离开了人世。临死前，他一再叮嘱家人要争取机会，使这部书广泛流传。
当李时珍去世的消息传开后，许多人都悲伤不已。下葬那天，从四面八方赶来许多会葬的人，就连贫苦的人们，也要到他的墓前抛下一陌纸，以表示对这位仁德的李大夫的难忘和感激之情。
在他去世后一年多，《本草纲目》印成了书。
李时珍生前曾说过：一部有价值的书，终究是埋没不了的。《本草纲目》出版后，各地医生纷纷前来购买，买回去一看，果然比《证类本草》要好得多。于是更多的人抢着要买这部书。50年内竟翻印了3次。直到今天，这部药典仍然是每个中医必读的书籍，并为世界药物学者和植物学者所重视。