一、简介
（一）热原反应与细菌内毒素
在临床静脉注射后，发生的发热、寒战、恶心、呕吐、头痛、腰痛及四肢关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强、昏迷甚至休克、死亡等一系列症状称为热原反应。而所有能引起热原反应的物质称为热原。
国内外文献有关热原的本质、结构的报道中，一致认为它是细菌内毒素（革兰阴性菌的代谢产物脂多糖），严格地讲不是每一种热原都具有脂多糖结构（热原物质还包括磷壁酸、酵母多糖等），但是所有已知的内毒素都具有热原活性。普遍接受的观点是：在（GMP条件下生产的药品的厦量控制，不存在内毒素意味着不存在热原。基于这些，目前通过检查注射剂巾的细菌内毒素的量以防止临床上出现热原反应。
（二）细菌内毒素检查法的定义与用途
细菌内毒素检查法（BET）系指利用革兰阴性菌的代谢产物脂多糖（LPS）与鲎试剂中的酶发生反应，进而测得细菌内毒素含量的方法。用于检测供试品溶液中内毒素含量是否符合规定、估测或者测定供试品中内毒素含量的方法。
（三）内毒素检查法的建立过程
（1）内毒素与鲎血凝集关系的发现1956年Johns Hopkzns大学动物学家Fredenk Bang发现革兰阴性细菌的粗提取物能使鲎的血细胞凝聚。
（2）鲎实验的建立1968年kevin和Bang用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是种酶反应，并创立鲎实验（细菌内毒素检查法前身）。
（3）有关机制的深人研究20世纪70年代后期多位学者从分子水半阐明鲎血细胞凝聚机制。
（4）对内毒素检查法旁路的发现1981年日本学者Iwanaga发现黉试剂中的G因子可以被真菌、酵母和藻类细胞壁中的一类细菌多糖B（1，3）—D—葡聚糖激活。而LPS则不能激活G因子旁路。
内毒素检查法的基本机制是内毒素在二价阳离子的存在下与鲎试剂中的B因子、C因子凝固酶原凝固蛋白原等发生的一系列酶促反应，最终形成了凝固蛋白（凝胶）。
（四）细菌内毒素检查法的分类
按照《中国药典》附录，细菌内毒素检查法可分为凝胶法和光度测定法。其中凝胶法包括限量实验和凝胶半定量实验。光度测定法包括浊度法和显色基质法。
凝胶限量实验是利用脂多糖与鲎试剂中的酶发生凝集反应产生凝固蛋白（凝胶），判断供试品中细菌内毒素含量是否符合规定的方法。
半定量实验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。系利用供试品系列与鲎试剂反应的终点浓度计算出供试品中内毒素的含量。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒紊反应过程中浊度变化而测定内毒素古量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特殊底物显色释放出的有色团的多少而测定内毒素古量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度增长速度的方法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当铡定结果有争议时，除另有规定外，以凝腔法结果为准。
（五）细菌内毒素检查法的基本实验内容
凝胶法细菌内毒素检查法的基本实验内容包括供试品、阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照。
光度测定法细菌内毒素检查法的基本实验内容包括供试品、阴性对照、标准曲线和供试品阳性对照。
细菌内毒素检查过程中的，阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必颁同时进行，否则实验结果无效。
二、实验准备
细菌内毒素检查法的实验准备工作包括实验用具、实验试剂的准备以及处理。
（一）实验用具的准备
天平（供试品称量用，精度为0．1mg以下）、电热干燥箱（除外源性内毒素用，温度应能达到250℃）、水银温度计或酒精温度计（精度在1℃以下）、漩涡混合器、细菌内毒素光度测定仪器（光度测定法使用）、移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、酒精棉、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿需经250℃干烤至少1h。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对实验无干扰的器械。
（二）对实验用具的处理
玻璃器皿的处理，目的是经过洗涤与于烤除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素，方法是将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液控于，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗3遍以上，控干。控干后放人适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放入烤箱。将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤30min以上。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则需再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
（三）实验试剂的准备
（1）鲎试剂，虚具有国家主管部门的批准文号。
（2）细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品。除另有规定外，应使用由中国食品药品检定研究院统一发放的标准品。
（3）细菌内毒素检查用水，系指内毒素含最小于0．015EU／ml（用于凝胶法）或O．005EU／ml（用于光度测定法）且对内毒素实验无干扰作用的灭菌注射用水。
（4）供试品，即待测样品。
（四）实验仪器的准备
凝胶限量实验和凝腔半定量实验：恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）
光度测定法实验：使用细菌内毒素光度测定仪器，包括试管型和酶标板型。试管型一般为专用的细菌内毒素光度测定仪器，而使用具有相应功能的酶标仪也可进行动态浊度法检测。终点显色法一般使用分光光度计。
三、基本实验操作
基本实验操作包括标准内毒素溶液、阴性对照液、鲎试剂的准备、阳性对照液、光度测定法标准曲线溶液、样品阳性对照液的制备方法和鲎试剂的准备方法、凝胶法加样与孵育的方法、凝胶法实验结果判定方法、光度测定法仪器的设置。
（一）标准内毒素溶液的制备
取细菌内毒素国家标准品或工作标准品1支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15min。然后根据需要进行稀释，相邻浓度间稀释倍数不得大于10，每稀释一步均应在漩涡混合器上混合30s，即可获得所需浓度的内毒素标准溶液（详细过程请参见标准品使用说明书）。
若使用的为细菌内毒素标准品，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装、保存。若为细菌内毒素工作品，为一次性使用。
（二）阴性对照液的制备方法
阴性对照溶液：即细菌内毒素检查用水。阴性对照实验用于检查所使用的内毒素检查用水以及实验环境是否存在问题，正常时结果应显阴性。光度测定法阴性对照正常时反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。
（三）阳性对照液的制备方法
阳性对照溶液：浓度为2．0λ（λ为所使用的凝胶鲎试剂的标示灵敏度）的内毒素标准溶液。
方法：按照标准内毒素溶液的配置方法，用检查用水将一支内毒素标准品溶解稀释，并制成标准内毒素浓度为2．Oλ的稀释液。即为阳性对照溶液。
阳性对照实验用于证明所使用鲎试剂以及标准内毒素的稀释是否存在问题，证明实验环境、保温温度等是否适合进行实验，正常时结果应显阳性。
光度测定法中的阳性对照是当实验使用的标准曲线并非本次实验的标准曲线时，用于检查本次实验标准内毒素的稀释是否存在问题，所配置的溶液浓度应为标准曲线范围内的已知浓度，测定结果应在已知值的50％～200％之间。
（四）光度测定法标准曲线溶液的制备
用检查用水将支内毒素标准品溶解稀释，并制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），如10、1、0．1EU／ml或O．5、0．25、O．125、O．0625、0．03EU／ml，但最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。
（五）样品阳性对照液的制备方法
样品阳性对照用于考察样品溶液是否对内毒素与擞试剂的反应存在干扰作用。一般情况下应显阳性。光度测定法中称为样品回收率实验。
1．凝胶法
用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2．0λ浓度的内毒素溶液。
供试品阳性对照制备举例：制备稀释倍数为8的供试品阳性对照液方法，取O．3ml浓度为4．OλEU／ml的内毒素标准液+0．3ml稀释倍数为4的供试品稀释液，制得0．6m1含2．0λEU／ml内毒素标准的稀释倍数为8的供试品稀释液。
2光度测定法
选择标准曲线中点或不靠近中点的内毒素浓度，设为λm，作为添加到供试品中的标准内毒素浓度。再用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成λm浓度的内毒素溶液。计算方法为R=（Cs－Ct）／λm，其中C为样品回收率实验管浓度，为该供试品浓度。
如使用的标准曲线为50、5、0．5、0．05 Eu／ml的标准系列，选择0．5EU／ml浓度作为λm。现需制备稀释倍数为4的供试品阳性对照液。可取O．3ml浓度为1．0EU／ml的内毒素标准赦+0．3ml稀释倍数为2的供试品稀释液，制得0．6ml含0．5EU／ml内毒素标准的稀释倍数为4的供试品稀释液。
国外还介绍了一种近似配置方法，直接配置所需要的供试品稀释液0．1ml，然后再加入10μl含10倍所需浓度的标准内毒素溶液，为该供试品稀释液。
（六）鲎试剂的准备
（1）凝胶法根据需要取鲎试剂若干支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内。按标示量每支加入规定体积（一般为0．lml）检查用水复溶，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若使用的鲎试剂规格不是0．lml／支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每O．1ml分装到10mm×75mm凝集管中，备用。
（2）光度测定法由于凝胶法鲎试剂和光度测定法鲎试剂在工艺上有所不同，因此在进行光度法检测时需使用专用鲎试剂而不能用凝胶法鲎试剂代替。光度法鲎试剂都为0．5ml以上装量，在溶解后需将所有鲎试剂混合在一起，备用。
溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。
（七）凝胶法加样与孵育的方法
（1）加样方法将已充分溶解的鲎试剂放在试管架上，按要求排好。每支鲎试剂加入0．1ml所要求的溶液（标准内毒素溶液、供试品稀释液、对照液等）。
（2）孵育方法加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放人37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60min±2min。
由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。
（八）凝胶法实验结果判定方法
将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180。观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。保温和拿取试管过程应避免试管受到振动造成假阴性结果。
（九）光度测定法仪器的设置
浊度法分为终点浊度法和动态浊度法，显色基质法也分为终点显色法和动态显色法。针对不同的方法，应配置相应的测定仪器。在实验开始前，应根据仪器的说明和实验的设计设定反应时间，反应温度（一般为37℃±1℃），检测波长等相关系数。供试品和鲎试剂的分装加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，需参照所用仪器和试剂的有关说明进行。
（十）实验注意事项
实验前，需用肥皂洗手，用酒精棉球消毒。在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将洗耳球中的气体吹人溶液中，以防止气体中的内毒素进人供试液。实验操作应在清洁环境中进行，过程中应防止微生物的污染。
四、凝胶法鲎试剂灵敏度复核与光度测定法标准曲线的可靠性实验
（一）凝胶法鲎试剂灵敏度复棱
凝胶法黉试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂灵敏度，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定，因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行任何实验前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。
实验步骤：
（1）细菌内毒素标准溶液的制备按照细菌内毒素标准溶液的制备方法，制备4个浓度的细菌内毒素标准溶液，浓度分别为2．Oλ、1．Oλ、O．5λ、0．25λ。
（2）待复核鲎试剂的准备按照鲎试剂的准备方法准备18管待复核鲎试剂，备用。
（3）加样与孵育将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0．1ml 2．0λ、1．0λ、0．5λ、0．25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入O．1ml检查用水。
加样结束后，按孵育方法孵育。
（4）观察并记录结果。
（5）实验结果计算如最大浓度2．Oλ4管均为阳性，最低浓度O．25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）
λc=lg负1上标（∑X／4）
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
（6）结果判断当λc在0．5λ～2．Oλ（包括0．5λ和2．Oλ）时判定该批鲎试剂是敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
（7）举例设待复核鲎试剂的灵敏度为0．125EU／ml。实验结果如下。
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