姬松茸组织分离包括种菇的选择、组织块分离、菌种纯化和出菇鉴定。
（1）种菇的选择。种菇要选择菇形圆整、色白、菇身粗壮、菌柄上下等粗或基部稍膨大、直立的单生菇、无病虫害的幼菇作为分离的材料。种菇最好要从小开始选，当姬松茸子实体直径长到2～3厘米时，就初步选定种菇，一般初选种菇20个左右进行观察，种菇直径在5厘米以上，菌膜尚未破裂，姬松茸有6～7成成熟度就可采收，进行分离。凡老熟菇、雨后菇、病虫菇不宜采用。图7子实体组织分离切割部分示意图
（方格内为种菇不同成熟度切割组织块处）
（2）组织块分离。菌种分离应在接种箱内酒精灯旁进行无菌操作。首先用75％的酒精棉球擦抹子实体表面进行消毒，将菇体用灭菌的解剖刀或刀片将菌柄纵切入1厘米左右（如图7），双手从菌柄处将子实体掰成两半，留下左手一半子实体，右手持接种刀或接种钩，灼烧并冷却后，在菌柄与盖的交界处，将菇体组织割成绿豆大的小块后，迅速移接至试管斜面中心。置于25℃左右下培养，让组织块萌发出菌丝。
（3）菌种纯化。当组织块上长出菌丝，并生长到约2厘米长时，选择菌丝粗壮、整齐、无杂菌感染的试管，切取尖端菌丝转接至另一支试管培养基上进行培养。若有细菌等杂菌污染，应进一步分离纯化，以获得纯培养菌丝体。
经纯化的菌种，要转接扩大至数支菌种，以便将一部分保藏起来，另一部分用作出菇鉴定。转接时，要标明分离时间和原始菌种的名称。
（4）出菇鉴定。将分离的菌种，与已经发出菌株的或国内推广应用的菌种，在同等条件下栽培做出菇试验。一般每个菌种的栽培数量，不得少于3米2。观察菌丝生长速度、出菇产量和出菇质量、转潮特点以及抗病性能等方面综合比较，确认其是优良品种后，才扩大繁殖，用于大面积生产。
新分离出来的菌种为原种，应采取长期保藏的方法，将它妥善保存起来。使用时，从中选出1～2支进行多次转接培养，扩大繁殖为生产用菌种。