正确使用高压灭菌锅，是保证灭菌效果和安全生产的保障。
（1）用前加足水。每次使用前务必向锅内加水，加的水一是要求水质清洁，二是加水量以达到水位标记为度，加水不能过多或过少。
（2）正确装载物品。为了便于蒸汽在灭菌锅内畅通循环，每次装载量要适当，放入灭菌锅的培养基和物料叠放不能过于紧密，一般要预留蒸汽通道，以免影响灭菌效果。
（3）排尽冷空气接通电源，进行加热。加热灭菌时打开排气阀，使锅内冷空气排出，当水沸腾时，大量蒸汽从排气阀中冲出，冷空气被排尽。冷空气的排除完全与否极为重要，因为若锅内留有冷空气，空气受热膨胀压力上升，这时压力表所表示的压力是水蒸气压力和部分空气压力的总和，不是水蒸气的实际压力（即假性蒸汽压），出现低温高压现象影响灭菌效果，致使灭菌不彻底，所以高压灭菌一定要排尽冷空气。
（4）升压、保压。当灭菌锅压力指标达到额定工作时才开始计算灭菌时间。母种培养基灭菌时常用压力为0.11兆帕，温度为121℃，加热灭菌30分钟；原种、栽培种灭菌压力常为0.175兆帕，温度126℃，灭菌1.5～2小时。
（5）降压、冷却。灭菌完毕后，首先关闭电器，让其自然冷却，待压力降到接近零时，再将安全阀和放气阀打开，然后方能打开盖子，取出灭菌物品。切忌灭菌后立即放气，以免溶液暴沸而溢出，或使塑料袋扎口脱绳和胀袋崩裂。