就在阮玲玉几乎被舆论淹没的时候，她在拍摄《新女性》的时候又不可救药地再次爱上了一个男人，这一次，就是《新女性》年轻的导演蔡楚生。在拍摄期间，蔡楚生也爱上了这个漂亮的女明星，而阮玲玉由于处在张达民和唐季珊的夹缝中，也正无处哭诉，因而倒在了蔡楚生的怀中。当唐季珊与张达民争得面红耳赤的时候，阮玲玉跑到蔡楚生那里，她希望蔡楚生和她一起私奔，逃出上海，然后“结了婚再回来”，但蔡楚生本性懦弱，且他的导演生涯刚刚开始不久，他显然不愿意为这个女人而自毁前程，他拒绝了阮玲玉。
阮玲玉失去了最后一颗救命稻草。
1935年3月7日晚，阮玲玉、唐季珊参加了联华电影公司的聚会，这是联华公司的经理黎民伟的宴请，他同时预祝阮玲玉打赢官司，洗刷冤情，曾跟阮玲玉合作过的导演孙瑜、费穆、吴永刚、朱石麟都出席了这次宴会。第二天，她将站到被告席上，因为张达民控告她重婚罪。公司的人都以为阮玲玉一定是面容愁苦，但当阮玲玉出现在宴会厅中的时候，人们发现阮玲玉一如往常，谈笑风生，脸上毫无即将面对法庭审判的愁云。公司的人见状也稍感欣慰，只是在宴会结束的时候，阮玲玉一反常态地与公司的每一个人一一告别，当时，人们以为这是阮玲玉饮酒过量有些激动，但其实阮玲玉根本没醉，她是在做最后的辞别。
在回家的路上，阮玲玉的司机回忆说，那晚，唐季珊和阮玲玉在车上发生了激烈的争吵。
回到家后，凌晨一点多，阮玲玉忽然下楼来，对母亲说，她肚子有些饿，想吃碗面条。母亲于是亲自下厨为她烧了一碗面条，阮玲玉接过面条就上楼去了，进了她和唐季珊的卧室。谁都没想到，她不是肚子饿了，而是想用这碗面条服下安眠药。她把整整三瓶30片安眠药悄悄倒进了面条里，然后吃下。吃完后，她在灯下铺开纸，写下了遗书，之后，她来到床上，伏在早已睡着的唐季珊怀里，说，“你能给我最后一点安慰吗？”
唐季珊一下惊醒，抬头四顾，猛然看到了阮玲玉梳妆台上的三个空瓶，他立即意识到阮玲玉服药了。唐季珊急忙坐起来，而此时阮玲玉已经陷入昏迷。唐季珊看到了桌子上的遗书，无暇多想，急忙下楼唤醒司机和阮玲玉母亲，然后将阮玲玉送到了日本人办的福民医院抢救——阮玲玉上次自杀也是送的这家医院。
到达医院的时间是凌晨3点，但福民医院晚间是没有医生值班的，无法抢救，于是唐季珊又将阮玲玉送往一家德国人办的医院，没想到，这家医院也没有值班医生，无奈，唐季珊只好将阮玲玉再次送到一家私人诊所。这是由陈达民、陈继尧兄弟开办的诊所，此时时间已经是清晨5点多钟，距离阮玲玉服药时间过去了整整4个小时。陈氏兄弟赶到后即急急忙忙开始为阮玲玉洗胃，并注射解毒药物，但仍不见效，而陈氏兄弟见状十分担心阮玲玉死在他们的诊所内，于是建议将阮玲玉送到设备齐全的中西疗养院抢救。中西疗养院位于浦石路，于是只好再次颠簸，把阮玲玉送到这家医院，但经过再次洗胃、吸氧、注射解毒针剂等仍毫无起色，唐季珊此时意识到阮玲玉这次可能是真的要走了。
不久，黎民伟接到了唐季珊的电话，急忙赶往医院，当见到昏迷不醒的阮玲玉后，他拍下了阮玲玉最后一张照片。
1935年3月8日下午6时38分，阮玲玉的心脏停止了跳动。
阮玲玉死后，唐季珊公布了她的遗书中的一份，那是给张达民的，遗书中严厉地谴责了张达民的无赖行为，最后连写了两句“人言可畏、人言可畏”，似乎阮玲玉就是死于张达民的逼迫和无情的舆论。当鲁迅听说阮玲玉自杀后，奋笔写了著名的《论人言可畏》一文，以他那一贯的语调论说强者与弱者之间可悲的关系。
1935年3月8日，阮玲玉在上海新闸路沁园村的住宅服安眠药自尽。消息传出，上海10万市民自发为她送葬，这一年，阮玲玉年仅25岁，正是一朵盛开的牡丹花。
但近年新发现了阮玲玉的两份遗书。那是在阮玲玉死去后一个半月，在上海一份名为《思明商学报》的报刊上发表出来的，当时，由于该报发行量很小，所以很多人并没有注意到。
其一是给张达民的：
“达民：我已被你迫死的，哪个人肯相信呢？你不想想我和你分离后，每月又津贴你一百元吗？你真无良心，现在我死了，你大概心满意足啊！人们一定以为我畏罪，其实我何罪可畏？我不过很悔悟不应该做你们两人的争夺品，但是太迟了！不必哭啊！我不会活了！也不用悔改，因为事情已到了这种地步。”
其二是给唐季珊的：
“季珊：没有你迷恋梁赛珍，没有你那晚打我，今晚又打我，我大约不会这样做吧！我死之后，将来一定会有人说你是玩弄女性的恶魔，更加要说我是没有灵魂的女性，但，那时，我不在人世了，你自己去受吧！”
“过去的织云，今日的我，明日是谁，我想你自己知道了就是。”
“我死了，我并不敢恨你，希望你好好待妈妈和小囡囡。还有联华欠我的人工二千零五十元，请作抚养她们的费用，还请你细心看顾她们，因为她们唯有你可以靠了！没有我，你可以做你喜欢的事了，我很快乐。玲玉绝笔。”
而《思明商学报》在刊登这两封遗书的同时登载了一篇文章，说明了遗书的来源，原来，这两份遗书就是由梁赛珍姐妹提供的。据文章交待，在阮玲玉服药自杀的当晚，唐季珊深恐受到社会压力，于是就让梁赛珍的妹妹梁赛珊模仿阮玲玉的笔迹，伪造了两份遗书，而将阮玲玉真实的两份遗书藏匿起来。梁赛珍姐妹看到了阮玲玉悲惨的结果，她们最后决定把阮玲玉的两份遗书交给媒体，然后这两姐妹就离开了上海，从此销声匿迹了。
中国人历来有一种俗不可耐的故事讲解法：如果是大众喜欢的明星，那么她一定是温柔的、美丽的、可怜的，而围绕她的男人一定是可恶的、无赖的、卑鄙的，但实际上人无完人，谁都不可能真正光明磊落。阮玲玉不过是个女佣的女儿，没有张达民，她注定一辈子生活在最低层，没有老茶商，她难以登上辉煌，没有蔡，她寻找不到感情的同情者，但她又回馈给他们了什么？女人们天天喊着要忠于爱情，终于婚姻，阮玲玉忠于张达民了吗？忠于老茶商了吗？