千百年来，人类跟细菌作着生死的斗争，细菌正吞噬着无数人的生命。到了20世纪，人们虽然发明了磺胺类药物，但对于凶险的细菌感染，还是束手无策。人们盼望着发明一种高效的药物，能够战胜各种细菌，让感染细菌的病人转危为安。
1928年9月，弗莱明开始研究葡萄球菌。当时的研究条件很落后，实验室设在一间破屋子内，潮湿闷热，充满着灰尘。他在做葡萄球菌平皿培养时需要多次开启平皿盖，所以培养物很容易受到污染。
一天清晨，弗莱明像往常一样，来到实验室。他发现昨天培养的那些葡萄球菌的器皿少了几个。今天还想拿它来实验呢，这些实验对象哪儿去啦？
弗莱明的助手不好意思地告诉他：“那些葡萄球菌被杂菌感染了，已经没法实验，只好放在一边，等会儿洗器皿的时候，一定会很好处理的。”说着助手取出已经收在柜里的器皿，想立即把里边的废液倒掉。
“且慢，”弗莱明突然灵机一动，“我正要寻找能杀灭葡萄球菌的药物，是什么杂菌破坏了它呢？”他仔细观察了一下报废的器皿，只见葡萄球菌的培养液基上，长出了一团青色的霉菌菌花，在菌花的周围，原先繁殖葡萄球菌的区域出现了一圈空白。弗莱明连忙把它制成玻片，放到显微镜下观察。
弗莱明只看了一眼，立刻发觉，培养基里原来繁殖得很多的葡萄球菌，居然都已经被消灭。他估计，是那些青色的霉菌在自身繁殖过程中分泌出一种液体，而这种分泌物杀死了与人类为敌千百年的葡萄球菌。
弗莱明十分兴奋，他放下了手里的其他一切实验，开始培养那些青色的霉菌。然后，把这些霉菌的分泌物滴进其他病菌的培养器皿中。结果与他偶然发现的现象相同，那些病菌一一被杀灭了。弗莱明终于发现了杀灭病菌最强大的武器，他把这种有无限希望的分泌物称作“青霉素”。
弗莱明培养了这种霉菌，并在其周围培植各种没类型的细菌。有些细菌长得不错，有的长到和霉菌达到一定距离时，就不再向前发展了。很明显，青霉素对有些病菌有影响，而对另一些则没有影响，他还在人体上进行青霉素治疗，也收到了良好的效果。
弗莱明发现青霉素后，好多人劝他赶快去申请专利。有了专利权，他便可以占有巨大的财富，这也是对他不懈努力的回报。可是，弗莱明却不这样认为，他说：“个人和家属的财富跟千百万人的幸福和生命怎能相比？我只不过在一个偶然的机遇中发现了青霉素。发现是一回事，用它造福人类又是另一回事。况且，把青霉分泌物中含量极少的有效成分提炼出来并不是我的长处，这工作需要经过许许多多人的共同努力。”
弗莱明毅然在1929年6月英国皇家《实验病理季刊》上公开了自己的发现，并申明希望有人能继续这项研究，制造出能造福人类的临床应用药用“青霉素”来。
第二次世界大战爆发后，新的抗菌物质的发现对医治伤员有着极为重要的意义。英国病理学家弗罗里和德国化学家钱恩进行了分离青霉素的工作并获得成功，即而创造生产了大量生产青霉素的新方法，于1944年正式生产，并得到了广泛应用。
1945年，弗莱明、弗罗里和钱恩共同荣获了诺贝尔奖。