4.2ELISA的不同类型
4.2.1间接法用于检测抗体：用抗原包被固相载体，然后加入被检血清，经孵育一定时间后，固相载体表面的抗原与对应的抗体形成复合物。经洗涤后，再加酶标抗抗体，加入底物显色。如被检血清为人、猪、兔、牛等动物时，也可用酶标SPA（PPA）代替酶标抗抗体，称为PPA-ELISA。
4.2.2双抗体法用于检测大分子抗原：用纯化的特异性抗体包被固相载体，加入待检抗原溶液后，洗涤除去多余的抗原，再加和酶标记的特异性抗体，孵育一定时间后，洗涤，除去多余的酶标记抗体结合物，最后加入底物显色。经酶催化后产生有色物的量与溶液中的抗原成正比。
4.2.3双夹心法既可用于检测大分子抗原，也可用于检测抗体：双夹心法需制备与待测抗原不同源的第一抗体（Abl）和针对Abl用不同种动物制备的抗抗体（Ab2）。其操作程序为：将抗体Abl包被于固相载体上，洗涤未吸附的Abl，加入待测抗原（Ag），使之与致敏固相载体作用，洗去未起反应的抗原，加入Ab2，使之与固相载体上的抗原与抗体复合物结合，洗涤后加入酶标记的抗Ab2抗体（Ab3），使之结合在Ab2上。结果形成Abl-Ag-Ab2-Ab3-HRP结合物。洗涤后加底物显色，呈色反应的深浅与标本中的抗原量呈正比。
4.2.4竞争法用于检测小分子抗原及半抗原：操作时分试验组和对照组作平行试验。
试验组：用特异性抗体包被固相载体，洗涤后加入含待测抗原溶液和一定量的酶标记抗原共同孵育。对照组，即在包被抗体的固相载体上仅加酶标抗原，用PBS替代待测抗原。洗涤后加入酶底物显色。对照应显色，可根据颜色变浅的程序，估测待检抗原含量。
4.3结果分析：定性试验可用肉眼观察依据反应颜色的深浅判定结果，呈橙色或黄色者判为阳性，浅黄接近无色或与对照无明显差异者判为阴性。定量试验用分光光度计，测试出的光密度吸收值进行分析：①超过预试验规定吸收值的被检样本均属阳性，此规定的吸收值是根据事先测定大量阴性样本所取得的，是阴性样本的均值加两个标准差。②以终点滴度表示，将被检样本作系列稀释，最高稀释度仍出现阳性反应（即吸收值仍大于规定的吸收值时），则该稀释度为被检样本的滴度。③以P／N比值表示。求出该被检样本的吸收值与一组阴性样本吸收值的比值，P/N比值大于2或3倍，即判为阳性。
4.4斑点ELISA（Dot－ELSIA）：斑点ELISA是近年创建的一项免疫酶新技术，此项技术既保留了常规ELSIA的优点，又弥补了抗原或抗体对载体吸附不牢的缺点，它具有敏感性、特异性强，被检样品的用量少，节省材料，不需特殊仪器，便于肉眼判定结果和长期保存等优点。因此，现在被广泛应用于动物传染病抗原、抗体的检测。
Dot－ELIS的基本原理是以纤维素膜（如硝酸纤维素膜或混合纤维素、脂微孔滤膜，孔径0.2～0.4舯）为固相载体，首先将抗原或抗体吸附在纤维膜的表面，通过与相应的抗体或抗原和酶标记抗体的一系列免疫反应，形成酶标记抗原抗体复合物，加入底物后，结合上的酶催化底物使其水解后氧化成另一种带色物质，沉着于抗原抗体复合物吸附部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点，试验结果可通过出现斑点与否和色泽深浅进行判定。
4.4.1操作方法：a、纤维素膜的处理及抗原包被，将纤维素膜用蒸馏水浸湿，待膜近于干燥时进行点样（抗原），每个样品加样10～20ul，于60～70℃烘干（或室温自然干燥），然后用洗液漂洗3次，最后用滤纸吸干。b、加被检血清于37℃湿盒中作用30～40min，漂洗方法同上。C、加酶标抗体，37℃湿盒中作用了30～40min，漂洗。d、显色，加入新配制的底物溶液，感作15min，漂洗，加2％H2S04终止反应，将膜晾干。
4.4.2结果判定：根据有无斑点及形成颜色深浅依次判为“++++”、“+++”、“++”、“+”和“-”。不形成斑点的判为阴性，实验时应设阴、阳性对照。
第六节其他血清学技术
一、病毒蚀斑技术
1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术（Virusplaque formation）成为许多病毒的滴定和研究方法。
1.原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性。为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位（PFU／m1）来表示。
2.技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆（无性繁殖纯系）、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。
2.1病毒生物学纯化（virus biological purification）：在进行血清中和试验时，常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性，这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂，或者已有许多变异病毒粒子存在其中，甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时，有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化，应用病毒蚀斑技术，挑选出各个不同的纯化病毒，亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖，测定其滴度，选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化，必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度，一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。
2.2蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test）：蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法。试验以使蚀斑数减少50％的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒（100PFU）与不同稀释度的等量血清混合后感作，接种预先准备好的单层细胞，再覆盖上营养琼脂置37℃二氧化碳培养箱培养，数天后分别统计蚀斑数，用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。
由于本试验的操作比较繁琐，目前在国内极少应用，国际上也没有把它作为一种各国都接受的诊断方法，仅在OIE国际动物卫生法典（第六版）中列为对裂谷热的规定诊断方法之一。
2.3操作步骤
2.3.1病毒滴定或纯化
2.3.1.1在灭菌的培养皿中培养合适的细胞，使形成单层。细胞培养时间约3-4天，接种量约为20O万个细胞/ml。选取单层细胞全部覆盖，不留有空洞的培养皿用作试验。
2.3.1.2用细胞培养液对病毒作10倍倍比稀释至10-7并保存于4℃。
2.3.1.3每个稀释度的病毒液接种3个平皿。
2.3.1.4接种前弃去细胞培养液，用5mlPBS或细胞培养液冲洗单层细胞，然后弃去冲洗液。
2.3.1.5每个平皿分别加入0.2ml病毒稀释液，对照组只用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱吸附1h，每15min摇动一次，以便使病毒均匀分布。
2.3.1.6按第3.1.4步骤冲洗未被吸附的病毒。
2.3.1.7取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.6％琼脂（预热）中，每个平皿加入7ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养约2天，平皿需倒置。
2.3.1.8取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的2％琼脂（预热）中，每个平皿加入5ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养至次日。
2.3.1.9结果计算求出每组3个培养皿的蚀斑平均数，组间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律（即若10-2组平均100个蚀斑，则10-3组平均应在10个左右），否则应考虑重新试验。以平均蚀斑数乘以病毒稀释的倍数再乘以5，即为每毫升病毒原液的蚀斑数。
2.3.1.10选取特征性的若干蚀斑，分别以弯头吸管在琼脂层下吸取蚀斑以收获病毒，然后分别接种到预先制备的单层细胞培养瓶中进行增殖或传代。
3.病毒血清型鉴定试验（纸片法）
3.1抗体纸片制备
3.1.1取已知各种血清型毒株以1×107蚀斑形成单位接种绵羊，接种后3-4周采血分离血清。
3.1.2制备直径0.5mm的中性滤纸片，121℃l5min灭菌后保存于干燥环境。
3.1.3取上述滤纸片浸入不同血清型的免疫血清后真空冻干，保存于4℃冰箱备用，使用前以灭菌水湿润。
3.2病毒接种
3.2.1用直径6cm的塑料培养皿培养BHK21或Vero细胞使成单层。
3.2.2以103PFU/0.2ml被检病毒接种于细胞上，吸附lh。
3.2.3洗去未被吸附的病毒，弃去洗液。
3.3覆盖琼脂
3.3.1取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.6％琼脂，每个平皿加入7m1，置平台冷却凝固。
3.3.2在琼脂面上按梅花形图案放上不同型的血清滤纸片，并做好记号。
3.3.3把平皿放置在37℃二氧化碳培养箱培养2天。
3.3.4真空吸出平皿中的滤纸片。
3.3.5取2倍浓缩的细胞营养液加入等量的2％琼脂，每个平皿加入5ml，重新置37℃二氧化碳培养箱培养2-3天，待明显蚀斑抑制环出现。
3.4结果判定：出现明显抑制蚀斑形成（即滤纸片位置下仍保持活细胞被染色）的免疫血清即为该被检病毒的血清型。
4.病毒（NDV）分离
4.1取疑似患病动物的组织用细胞培养液匀浆，离心沉淀后取上清液。
4.2用16孔微量培养板制备鸡成纤维原代细胞。
4.3细胞长成单层后吸去培养液，向每孔滴加0.1ml被检病料，置37℃吸附2h后弃残液。
4.4制备1％琼脂的BME，置40—50℃水浴待用。
4.5吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成覆盖层。
4.6把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。
4.7制备含0.002％中性红的1%琼脂的BME，置40—50℃水浴待用。
4.8吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成第二覆盖层。
4.9把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48h内观察结果。
4.10挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。
注：苯试验方法在样品中病毒含量少的情况下比单纯用细胞培养分离要敏感。
5.试验用各种成份的配制
5.1细胞营养液（用于稀释病毒）
成份：10倍199保存液4ml
犊牛血清0.8ml
3％碳酸氢钠2.2ml
双蒸水40ml
5.2两倍浓缩细胞营养液（配制首层琼脂用）
成份：10倍199保存液20ml
犊牛血清4ml
3%碳酸氢钠12ml
1％二乙氨基乙基（DEAE）10ml（可选择）
双蒸水54ml
（置40—45℃水浴备用）
5.31.6％琼脂
成份：精制琼脂糖1.6g
双蒸水加至l00ml
（121℃高压灭菌15min，置40-45℃水浴备用）
5.4含中性红两倍浓缩细胞营养液（配制第二层琼脂用）
成份：10倍199保存液20ml
犊牛血清l0ml
3%碳酸氢钠12ml
0.5％中性红6ml
双蒸水52ml
（置40—45℃水浴备用）
说明：在第二层琼脂中，中性红的最终浓度应为1：5000-1：10000
5.52％琼脂：精制琼脂糖2g
双蒸水加至100ml
（112℃高压灭菌15min，置40-45℃水浴备用）