三、抗体稀释法补体结合试验
1.材料准备
1.1抗原：将病毒、细菌、立克次氏体和原虫等经适当处理后，均可作为补体结合抗原。在制备病毒抗原时，需对原始病毒材料进行适当纯化，以提高抗原的特异性，通常用反复冻融后再离心沉淀，去除细胞碎片，用丙酮、乙醚抽提以去除脂类物质，用去氧胆酸钠和吐温-80处理，使病毒粒子分散，逸去病毒抗原，也可用其他理化方法加以提纯。细菌通常用酚法提取菌体抗原（脂多糖），钩端螺旋体、锥虫等可使用裂解剂制备出菌（虫）体裂解抗原。目前已有许多市售的商品化抗原供使用。
在制备某些病毒、立克次氏体和原虫的抗原时，需用同一未接毒的正常组织、细胞培养或鸡胚培养液，用同法处理作为正常抗原对照。
1.2血清：被检血清按常规方法采集，最好在次日晨喂饲前采集，以免血清中混有脂类物质，出现抗补体作用。阳性血清通常用兔或豚鼠制备，也可采用病愈后的康复血清。采集的血液血清析出后及时离心分离，以免溶血。血清在检验之前需进行灭活，灭活温度视动物种类不同而异，牛、马和猪的血清一般用56—57℃，山羊和绵羊血清用58～59℃，驴、骡血清为63～64℃，兔血清为63℃，人血清用60℃，用60℃以上温度灭活的血清可先将血清作l：2或1：5稀释，以免凝固、变性，灭活时间一般为30min。
1.3补体：通常用3～5只健康雄性豚鼠混合血清作补体，以避免个体差异。采血前一天下午禁食，次日空腹采血，取血后放人4℃冰箱，2～3h内分离血清，立即分装小瓶，于低温冰箱冻结保存，可使用1个月，也可从生物药厂购买冻干补体。新鲜补体室温下保存时间为24h左右。
1.4绵羊红细胞：自健康绵羊采集脱纤血液，加入等量阿氏（Alseluer‘s）液，4℃冰箱可保存1个月，用前吸出所需量，加5～10倍生理盐水，反复洗涤3次，最后用3000r/min离心20min，按压积红细胞量加生理盐水配成所需浓度的红细胞悬液，或1％或2％或2.5％或4％等。
1.5溶血素：系用绵羊红细胞多次免疫家兔制成，可从生物制品厂购得。
1.6稀释液：有生理盐水，钙镁盐水，巴比妥缓冲液（VB液）、明胶巴比妥缓冲液（GVB液）等。
在作补体结合试验时，无论采用那种方法，从预备试验开始一直到正式试验为止，要求做到所用的稀释液一致、红细胞浓度一致、各成分（抗原、血清、补体、溶血素、红细胞）的加人量一致，每管最后的总量相同（或0.6ml，或1.25ml或为2.5m1），有些对照管，省去了某成分，应以稀释液补充其省去的量。
2.预备试验
2.1溶血素效价测定
2.1.1溶血素的稀释：取0.2ml含等量甘油防腐的溶血素，加9.8ml稀释液配成1：100基础稀释液，按方法作进一步稀释。
2.1.2溶血素效价：按加入各成分，而后37—38℃水浴20min
从水浴中取出，立即判定结果，用其1：20补体0.25ml，在37—38℃水浴20min，能使2.5%红细胞液0.25ml完全溶血的最小量溶血素为溶血素效价或称一个单位溶血素。以溶血素效价测定表为例，对照管均不溶血，1—6管完全溶血，则溶血素效价为1：3000倍。在正式试验时溶血素的工作效价为滴定效价的倍量或称2单位溶血素，则工作效价为1：1500倍稀释。效价测定后的溶血素，可在2—3个月内按此效价使用，不必重测。
2.2补体效价测定：每次补体结合试验，应于当日测定补体效价.用稀释液将补体作1：10稀释，加入各种成分后，前后经37—38℃20min水浴2次。
补体效价测定方法之一单位：ml
管号
12345678910
对照
111213
1：10补体加入量
0.050.060.070.080.090.100.110.120.130.140.2500
稀释液加入量
0.200.190.180.170.160.150.140.130.120.110.750.750.75
工作量抗原加入量（不加抗原量加稀释液）
0.250.250.250.250.250.250.250.250.250.25000
5倍稀释阳（阴性血清
0.250.250.250.250.250.250.250.250.250.25000
振荡均匀后置37℃—38℃水浴20min
二单位溶血素
0.250.250.250.250.250.250.250.250.250.2500.250
2.5%红细胞悬液
0.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.25
振荡均匀后置37℃—38℃水浴20min
结果
阳性血清加抗原
#############
阳性血清不加抗原
##++++++-----
阴性血清加抗原
##++++++-----
阴性血清不加抗原
##++++++-----
注：#完全不溶血，+++微溶血，++50％溶血，+微不溶血，-全溶血。
补体效价，即在2单位溶血素存在情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需的最小补体量，就是所测得的补体效价。如上表补体效价测定方法之一中的第6管10倍稀释的补体0.1ml即为一个单位补体。在使用时原补体应稀释倍数的计算：
原补体应稀释的倍数=补体稀释倍数/测得效价×使用时每管加入量
按上列公式：10/0.10×0.25=25
即此批补体应作25倍稀释每管加0.25ml即为工作量补体或一个单位补体。因补体性质不稳定在操作过程中会降低。故使用时稀释的浓度比原效价高10％左右，即本批补体应作1：22倍稀释，每管加0.25ml。
另外，补体效价也可用下述方法进行测定，即取三列试管，按加入各种成分，第一列加标准抗原，第二列加正常（组织）抗原，第三列不加任何抗原，而加钙镁盐水。各列均加人含量不同的补体，37℃水浴30min后加入致敏红细胞，振摇后37℃水浴30min，判定结果。
在有标准抗原、正常抗原、无抗原的三排管中，能使红细胞全部溶解的最小补体量为一个补体单位，例的10倍稀释补体，0.11ml即为1个单位补体，在正式试验使用时，其原补体的稀释方法与补体测定方法之一相同。
2.3抗原效价测定将标准阳性血清和标准抗原分别作倍比稀释（2×～128×）共7个稀释度进行方阵滴定。按加入抗原和血清各0.25ml，然后分别加入工作量补体0.25ml，并补足对照管中的稀释液（或钙镁盐水）量，将各管摇匀，置37℃水浴1h，病毒抗原多用4℃过夜，次日取出置37℃水浴20mim。各加入致敏红细胞0.5ml，振荡混合后，再置37℃水浴20min，判定结果。
在标准抗原、阳性血清、正常抗原及正常血清对照成立无误的情况下，能与最大稀释倍数的阳性血清发生完全抑制溶血的抗原最大稀释倍数，为1个抗原单位，反之亦然。
抗原效价测定示例：抗原1：32，阳性血清1：16各为1个单位。正式试验时，采用2或4个单位，即抗原用1：16或1：18，阳性血清1：8或1：4。
2.4溶血度标准比色管的制备为了正确判定溶血程度，可利用试验中完全溶血的溶液混合，作为溶血溶液，按表7－13配制。
标准比色管的配制及反应判定标准单位：ml
试管号
1234567891011
溶血程度%
0102030405060708090100
溶血溶液
00.250.500.751.001.251.501.752.002.252.50
2.5%红细胞
0.500.450.400.350.300.250.200.150.100.050
稀释液
2.001.801.601.401.201.000.800.600.400.200
叛定符号
##+++++++++++-
++++-+
--
叛定标准
阳性
疑似
阴性
3正式试验
3.1定量试验：每一待检血清用10支试管，第1～6管加不同稀释倍数的待检血清，7、8两管加正常组织的抗原对照，9、10两管为血清抗补体对照。按表7－14加入反应的各种成分，振荡后，置37℃，或置4℃冰箱过夜，取出温热至37℃，然后加入致敏红细胞，振荡后，置37℃水浴30min，观察结果。
正式试验（定量试验）操作程序表
123456
78
910
管号
正式试验管
正常抗原对照
被检血清对照
待检血清稀释度
2×4×8×16×32×64×
2×4×
2×4×
血清量
0.250.250.250.250.250.25
0.250.25
0.250.25
标准抗原（工作量）
0.250.250.250.250.250.25
--
--
正常抗原
------
0.250.25
--
钙镁盐水
------
--
0.250.25
补体（工作量）
0.250.250.250.250.250.25
0.250.25
0.250.25
振摇后，37℃水浴lh，或4℃冰箱过夜，取出温热至37℃
致敏红细胞
0.250.250.250.250.250.25
0.50.5
0.50.5
振摇后，37℃水浴30min
结果举例
####+++-
--
--
以能抑制溶血在“++”以上的血清最大稀释倍数为该血清的补体结合效价，如正式试验（定量试验）操作程序表可知该血清效价为l：32。
为验证正式试验是否成立，还应按加入各种成分，作为阳性血清、阴性血清对照以及补体单位对照，如结果与表中的预期结果不符，试验作废，应重做。
正式试验中的阴、阳性血清和补体对照单位：ml
管号
1234
56
78
阳性血清对照
阴性血清对照
对照性质
补体对照
16×32×
2×4×
稀释血清
----
0.250.25
0.25O.25
标准抗原
0.250.250.250.25
0.250.25
O.250.25
补体（工作量）
0.050.100.150.20
0.250.25
0.250.25
钙镁盐水
0.450.400.350.30
--
--
振摇后，置37℃水浴30min
致敏红细胞
0.50.50.50.5
0.50.5
0.50.5
振摇后，置37℃水浴30min
正确结果
+++--
#+++
--
3.2定性试验每份被检血清作1：5或1：10稀释经灭活后加入试管内，每管0.25ml，其中1管加工作量抗原0.25ml，另一管加稀释液0.25ml，每管加人工作量补体0.25ml，摇匀置37℃水浴30min，或4℃过夜，取出加热至37℃，每管加两单位溶血素0.25ml和2.5％红细胞悬液0.25ml，摇匀置37℃水浴30min，取出进行判定。每次试验应设标准阳性血清、阴性血清、补体、抗原、溶血素以及红细胞对照。试加入反应的各种成分。
正式试验（定性试验）操作程序表单位：ml
检样
对照
管
号
12
345678910
被检血清
阳性血清阴性血清补体抗原溶血素红细胞
血清
0.250.25
0.250.250.250.250000
工作量抗原
0.250
0.2500.25000.2500
工作量补体
0.25O.25
0.250.250.250.250.250.2500
稀释液
00.25
00.2500.250.750.250.751.0
37～38℃水浴30MIN
两单位溶血素
0.250.25
0.250.250.250.2500.250.250
2.5%红细胞
0.250.25
0.250.250.250.250.250.250.250.25
37～38℃水浴30min
结果判定
#-
#---#-##
在各项对照试验正确无误的条件下，可对被检血清进行判定，被检血清加抗原管为0％～50％溶血判为阳性，60％～80％溶血判为疑似，90％～100％溶血判为阴性。在进行溶血程度的判定时可比照标准比色管记录结果。
四、补体稀释法补体结合试验
1.材料准备同抗体稀释法补体结合试验
2.预备试验
2.1溶血素效滴定：将稀释成1：1000、1：2000、1：3000直至1：9000不同稀释倍数的溶血素，分别滴入微量板的第1-9孔，每孔1滴，然后依次加入40×补体，每孔两滴；加GVB液每孔2滴，加入4%红细胞悬液每孔1滴，置37℃水浴10min，观察结果。红细胞全部溶解的溶血素最大稀释度为1个溶血素单位，正式试验时，用2个溶血素单位。
2.2补体效价滴定
补体稀释和滴定法
成分管号
123456789
GVB液
补体
933333333
177777777
用9支试管按加入GVB液，吸取补体1ml加入第1管，混匀后吸7ml于第2管，依次顺序稀释至第9管。