第三节中和试验
中和试验（neutralization test）是指动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验是以测定病毒对宿主细胞的毒力为基础，因而首先应根据病毒特性选择适宜的细胞、鸡胚或实验动物，然后测定其毒价，再比较用免疫血清和正常血清中和后的毒价，来判定该免疫血清中和病毒的能力一中和价。
中和试验不仅能鉴定病毒的种型，用于病毒抗原分析，还可用于中和抗体效价滴定。毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验相同。
一、病毒毒价的测定
1.毒价单位在病毒学或其他病原微生物的研究中，常需对病毒的毒力或毒价进行滴定。衡量病毒毒价（毒力）的单位过去多用最小致死量（MLD50）或最小感染量（MIDso），即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡或感染的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，越接近100％死亡时或感染，剂量的递增越不敏感。而一般在死亡（或感染）率越接近50％时，剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量（LD50）或半数感染量（LD50）作为毒价测定单位。即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡或感染的剂量。由于对LD50（ID50）的计算应用统计学方法减少了个体差异的影响，因而比较正确。病毒对于试验对象的致病作用不一定都以死亡作为标志，如以感染发病为标志用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数感染量（EID50）。用细胞培养测定时，则为细胞半数感染量（TCID50）。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量（IMD50）或半数保护量（PD50）。
2.半数计量（LD50，ElD50，TCID50）测定与计算
2.1测定方法：半数计量测定时，通常将制备的病毒液（原液），以10倍递增稀释成不同稀释度，选择4～6个稀释度，分别接种于敏感细胞或鸡胚或动物。每个稀释度接种4～6管（只）。接种后观察一定时间内的死亡（或出现细胞病变）数和存活数。以细胞培养法为例，将4个稀释度（10-4、10-5、10-6、10-7）的待测病毒分别接种细胞培养管6只，每管0.1ml。接种病毒后的细胞管置于细胞培养盘内，细胞层一侧在下，使病毒与细胞充分接触，放置37℃下吸附1h。加入维持液，置37℃培养，在一定的时间内逐El观察并记录出现的细胞病变（CPE）情况。
2.2半数计量的计算：毒力测定观察结果。
按Reed和Muench两氏法：首先按表求出距离比例。距离比例=（高于50％死亡百分率-50％）／（高于50％死亡百分率-低于50％死亡百分率）=（88-50）／（88-29）=0.64。然后再按TCID50的对数=高于50％病毒稀释度的对数+距离比例X稀释系数的对数。试验举例中高于50％病毒稀释度的对数为-5，距离比例为0.64，稀释系数的对数为-1，代人上式。
Lg TCID50=-5+0.64×（-1）=-5.64，即TCID50=10-5.64／0.1ml
按Karber氏法计算，其公式为：lgTCID50（LD50，MID50）=L+d（s-0.5）。L为
病毒最低稀释度为的对数，d为组距，即稀释系数的对数，s为死亡（或感染）比值的和。如上举例，L=-4，d=-1，S=6/6+5/6+2/6+0/6=2.16，将数值代入公式。
lgTCID50=-4+（-1）×（2.16-0.5）=-5.66，即TCID50=10-5.66／0.1ml。
2.3半数剂量和毒价的表示法：病毒的TCID50（或LD50，ElD50，）可用负对数表示，如前述举例病毒的TCID50为
5.64，但这个数不能表明剂量，只有将其还原才能成为剂量，即该病毒的TCID50为105.66／0.1ml。10-5.66是一个稀释度，即1/10-5.66稀释的病毒，0.1ml能使半数细胞出现细胞病变。因此必须表明接种剂量0.1ml。也可将其化成以毫升为单位，10-5.66／0.1ml=10-6.66／ml。以毫升为单位时，可不标明单位。但必须指出上例测得的结果不能写成为10-5.66。
三、中和试验
中和试验时测定血清中和后的残余毒力，通过对中和后病毒50％的滴定，以判定血清的中和效价。中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列稀释（即10倍递增稀释）的病毒混合；然后把血清病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后，测定血清阻止病毒感染的能力及其效价。如果接种血清一病毒混合物的宿主与对照（指仅接种病毒的宿主）一样地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。中和试验不仅能定性而且也能定量。用细胞培养进行中和试验，有常量法和微量法两种。因微量法简便，结果易于判定，适于作大批量试验，所以得到了广泛的应用。
1.固定血清一稀释病毒法（病毒中和试验）
将病毒原液做10倍系列稀释，分装到两列无菌试管中，第一列加等量正常血清（对照组），第二列加等量待检血清（试验组），混合后放置37℃1h，然后分别接种实验动物（鸡胚或细胞培养），记录每组死亡数（或CPE数），分别计算TCID50或LD50和中和指数。中和指数为试验组与对照组的TCID50或LD50对数之差的反对数。
中和指数=试验组LD50/对照LD50
举例：中和指数=10-2.2/10-5.5=10-2.2（-5.5）=103.3
试验举例
病毒稀释
10-1lO-210-310-410-510-610-7LI50
正常血清对照组
待检血清试验组
4/43/41/40/410-5.5
4/42/41/40/40/40/40/410-2.2
查3.3的反对数为1995，故103.3=1995，也就是该待测血清中和病毒的能力比正常血清大1995倍。在中和试验的结果判定时，通常待检血清的中和指数≥50者判为阳性，10～49为可疑，<；10为阴性。
2.固定病毒一稀释血清法（病毒中和试验）
用细胞培养进行本项实验时，可采用微量法。
本试验首先测定病毒毒价，然后将病毒稀释成每单位含200LD50（或ElD50，ID50）与等量倍比系列稀释血清混合，置37℃lh。每一稀释度接种3～6只实验动物胚或培养细胞），在观察期间记录存活数和死亡数（或有无CPE的细胞培养数），在各项对照成立的情况下，按Reed和Muench两氏法或Karber氏法计算其半数保护量（PD50），即该血清的中和效价。在实施本实验时特别是使用细胞培养的微量法时，应设置如下对照：
病毒回归试验：每次试验每一块微量板均应设立病毒对照，先将病毒作0.1，1，100和1000TCID50，每个稀释度接种4孔，每孔加50ul，然后每孔加lOOul细胞悬液。随试验观察0.1TCID50不会引起CPE，而100TCID50必须引起CPE，否则试验无效。
血清毒性试验：为观察被检血清对细胞有无毒性作用，应该设立本对照，即在细胞培养中加入低倍稀释的血清（相当于中和试验中被检血清的最低稀释度），细胞应正常无变化。
正常细胞对照：既不接种病毒也不接种待检血清的细胞悬液孔，在整个实验过程中细胞正常无损，并保持良好的形态和生长特性。
可见PD50介于10-1.8和10-1.2之间，PD50对数的计算按Reed和Muench两氏法计算，可代入如下两个公式中的一个，求得的结果相同。
其一，lgPD50=低于50％死亡（CPE）百分率稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数
[距离比例=（50％-低于50％死亡百分率）/（高于50％死亡百分率-低于50％死亡百分率）]
其二，lgPD50=高于50％死亡（CPE）百分率稀释度的对数一距离比例×稀释系数的对数
[距离比例=（高于50％死亡百分率-50％）/（高于50％死亡百分率-低于50％死亡百分率）]
按其一方法上例中的距离比例=（50-17）/（60-17）=0.77，代人公式lgPD50=-1.2+0.77×（-0.6）=-1.66，PD50=10-1.66
按其二方法上例中的距离比例=（60-50）/（60-17）=0.24，代人公式lgPD50=-1.8-0.24×（-0.6）=-1.656，PD50=10-1.656
通过计算表明这两种方法所得结果是一致的，即该血清的中和效价为1：46。
第四节补体结合试验
补体是机体的一种重要的体液因子，属一组正常血清蛋白成分，可被抗原抗体免疫复合物激活产生具有裂解细胞壁的因子。如果该过程发生在红细胞表面上则导致红细胞裂解而出现溶血。利用这种反应来检测血清中的抗体或抗原，称作补体结合试验（complement fixation test，CFT）。
一、原理CFT包括两个系统，第一为反应系统，又称溶菌系统，即已知抗原（或抗体），被检血清（或抗原）和补体。第二为指示系统（亦称溶血系统），即溶血素+绵羊红细胞，溶血素即抗绵羊红细胞抗体。补体常用豚鼠血清，它对红细胞具有较强的裂解能力。补体只能与抗原-抗体复合物结合并被激活产生溶血作用。因此，如果试验系中抗原和抗体是对应的，形成了免疫复合物，定量的补体就被结合，这时加入指示系统，由于缺乏游离补体，就不产生溶血，即为阳性反应。反之试验系中缺乏抗原或特异性抗体，不能形成免疫复合物，补体就游离于反应液中，被指示系统，即溶血素+绵羊红细胞免疫复合物激活，而发生溶血，即阴性反应。为了测定阳性血清中抗体的效价，可将血清作系列稀释，其结果是由完全不溶血逐步达到完全溶血，发生50％或100％溶血的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价。
在进行CFT主试验之前，抗原、补体、绵羊红细胞和溶血素必须经预备试验测定。所加补体的量必须准确，补体少导致不完全溶血，出现假阳性结果；反之，超量的补体不能被反应系统的免疫复合物完全结合，从而出现假阴性结果。超量的抗原影响补体的结合，抗原不足不能完全结合补体。
在CFT操作中，经常遇到的一个问题是被检血清存在“抗补体作用”。即被检血清在无抗原存在的情况下结合补体。这有多种可能的原因，主要原因是血清取自感染动物，在血清中存在免疫复合物；或者血清被细菌污染，通过其他途径激活了补体。
二、分类布体结合试验分直接法、间接法和固相法。
1.直接法该法为最常用的操作方法，在试管中加抗原、被检血清和补体，在一定温度下感作一定时间后，加溶血素和红细胞，再感作一定时间后判定结果。直接法又根据试剂量的差异分为常量法和微量法。常量法试剂总量一般为1.0～2.5ml，微量法一般为0.125ml。前者在试管内进行，后者在U形底的96孔微量反应板内进行。
2.间接法该法用于禽类血清抗体的测定（如鸭、火鸡、鸡等）。因其血清抗体与相应的抗原形成复合物后不能结合豚鼠补体，需再加一种抗该抗原的兔抗体，后者形成复合物后可结合豚鼠补体，然后再加补体和溶血系统成分。与直接法相比间接法多加一种特异性免疫抗体，多进行一次感作。其结果判定正好与直接法相反。发生溶血时表示抗原已和血清中的抗体结合，阻止了兔抗体与抗原的结合，补体仍然游离存在，然后与溶血素结合，发生溶血，即为间接CFT阳性；反之，若血清中无相应的抗体存在，抗原则与兔抗体结合形成免疫复合物结合补体，不发生溶血，即为间接CFT阴性。
3.固相法固相法的原理与直接法相同，其不同点是所有的反应是在琼脂糖凝胶反应皿中进行。其操作程序为先将溶血素致敏的红细胞液加入溶化后冷至55℃的1％琼脂糖凝胶中，混匀，倾注入特制的塑料反应皿内（反应皿规格为90mm×25mm，凝胶量为25m1）。待其凝固后打孔，孔径为6mm，孔距不得小于8mm。然后将在37℃温箱中感作一定时间的抗原+被检血清+补体的混合物取25ul加入孔中，37℃感作一定时间，观察溶血环的直径以确定结果的阴阳性。