5.11布氏杆菌鉴别染色法（科兹洛夫斯基氏染色法）
染色液的配制：
A液（2％沙黄溶液）：沙黄2.0g
蒸馏水lOOml
混合溶解，滤过即成。
B液（1％孔雀绿溶液）：孔雀绿1.0g
蒸馏水lOOml
混合溶解、滤过即成。
染色法：涂片、干燥、火焰固定；滴加2％沙黄溶液，将载玻片置火焰上加热，微温至产生蒸气约1～3min，冷却、水洗；滴加1％孔雀绿溶液染色l～2min，水洗、干燥、镜检。
结果：布氏杆菌呈红色，其他细菌或细胞呈绿色。
5.12螺旋体染色法（钩体镀银染色法）
染色液的配制
A.吐温80储存液：吐温8010mL
95％酒精lOOmL
混合即成。
B.固定液：吐温80储存液2mL
甲酸（80％～100％）5mL
95％酒精10mL
现用时混合即成。
C.染色液：硝酸银5.Og
蒸馏水lOOmL
混合即成。
D.显影液：对苯二酚200.0g
吡啶2.5g
松香饱和液lmL
无水亚硫酸钠50.0g
蒸馏水90mL
E.松香饱和液：松香lOOg
乙醇lOOmL
取A、B、C放在一个清洁干燥的lOOmL烧杯内溶解，另将D、E放在另一个烧杯内溶解，可略加温，然后将两杯溶液混合，使成乳状液，即可使用。此液装入黑色瓶内，外包以黑纸。经几天或稍长时间后，变为深黄色，便大部分失效，应另配新液。
染色法：
①涂片、干燥、滴加固定液1～2min，水洗；
②将载玻片放于60℃水锅的架上，加染色液染5min，弃去；
③加显影液待出现黄色或棕色，水洗、干燥、镜检。
结果：背景为黄色或棕色，螺旋体为黑色或褐灰色。
5.13真菌染色法
5.13.1过碘酸锡夫氏染色法
染色液的配制。
甲液：1％过碘酸水溶液。
乙液：碱性复红0.1g
95％酒精5mL
蒸馏水95mL
依上程序溶解即成。
丙液：二亚硫酸锌（Zinc hydrosulfite，Zn02S4）1.0g
酒石酸0.5g
蒸馏水100mL
混合溶解即成
丁液（饱和苦味酸液）：苦味酸1.22g
蒸馏水100ml
混合即成。
染色法：制片、干燥；加甲液染10min，水洗；加乙液染2～3min，倾去；加丙液染30～40min，至载玻片呈淡粉红色，水洗；加丁液染3min，充分水洗。
结果：真菌组织染成鲜红色。
5.13.2乳酸酚棉蓝染色法
染色液的配制：
纯石炭酸20.Og
乳酸20mL
甘油40mL
蒸馏水20mL
棉蓝0.05g
将1、2、3、4混合，加温溶解，再加棉蓝，摇匀即成。
染色法：取洁净载玻片中央加染色液2滴；用接种针挑取培养物检样放于染色液中；左右手各持一接种针待将检样布匀，覆盖盖玻片，微加温后镜检。
结果：真菌为蓝色。
5.14马夏维洛（Maechiaveilo）染色法：此染色法用于立克次氏体、病毒包涵体的染色。
染色液的配制：
复红液：O.25％碱性复红水溶液，pH7.2～7.4，过滤即可。
柠檬酸液：0.5％柠檬酸水溶液。
美蓝液：1％美蓝水溶液。
染色法：
①涂片或触片加热固定。
②滴加复红液染色4min。
③用柠檬酸液迅速洗去染料，脱色数秒后，立刻用自来水冲洗。
④用美蓝染色15min。
⑤水洗、干燥、镜检。
结果：立克次氏体呈红色，组织胞浆呈淡蓝色，细胞核呈深蓝色。
6.细茵大小的测量细菌的形体微小，要用光学显微镜放大几百倍到千倍左右才能看见，通常微米作为测量其大小的单位（1um=1／1000mm）。不同种类的细菌大小不一，同一种细菌也可因菌龄和环境因素的影响，其大小可有差别。一般球菌的平均直径为1.Oum左右，杆菌为2～8um×0.5～lum，螺旋菌为0.3～lum×1～20um。使用显微测微计来测量，以生长在适宜的温度和培养基中的幼龄培养物为标准，并以多个菌体的平均值或变化范围来表示。确定和比较细菌大小时，各因素、条件和技术操作等均应一致。
测量细菌大小的装置称为测微计，它由两部分组成，一是接目测微计，二是接物测微计。
接目测微计，为二个圆形玻片，中央部刻有50～100个等分小格，小格的长度不定，随接目镜与接物镜的放大倍数不同而异。因此，测量细菌大小之前，必须应用接物测微计来确定每一个小格的长度。使用时将接目测微计装入接目镜的中间部。
接物测微计，在载玻片的中央，有一圆形小玻片，在上面刻有100个小格，每一小格的长度为lOum，其全长为lmm。
测量时，首先固定镜筒的长度，然后在油镜下使接物测微计与接目测微计的小格重叠。借以求出接目测微计的一个小格的绝对值。例如，接目测微计的7个小格与接物测微计的一个小格重叠时，则接目测微计一个小格的值为7：10=l：x，x=10/7，x=1.43，即1个小格为1.43um。然后，取下接物测微计，放上欲测标本，检查标本上细菌的长或宽相当于接目测微计的几个小格，即为菌体的长或宽。
二、细菌的生化试验
细菌在含有一定化合物的培养基中生长后，由于细菌的分解与合成作用，可使该物质转化为其他物质。细菌产物的性质随细菌种类不同而异，可借助于生物化学方法测定出来，这种方法称为细菌的生化反应试验，又称生物化学特性检查法。
细菌的分解代谢和合成代谢受其本身的酶控制。若某一细菌含有某一种酶，该菌就可以把相应的物质转化为其他物质，而出现可见的反应。若无此酶，则无此反应。细菌的种类很多，它们所含有的酶也各不相同。因此，应用生物化学的方法来检测这些产物的性质，有助于对细菌的鉴别和鉴定。细菌的生化反应在种、型鉴别工作中具有重要价值，是继形态学鉴定之后的又一重要鉴别依据。可以用生化试验方法鉴定细菌，这是细菌鉴定的一个重要方面。下面介绍常用的生化试验方法。
1.糖类代谢试验
1.1糖发酵试验
1.1.1原理：细菌分解糖可产生有机酸或CO2和水，产酸可通过指示剂的颜色变化来检验，产气可见试管内倒立的小发酵管中蓄积的气体。如为半固体糖发酵，则可见到颜色改变和气泡在半固体中。
1.1.2培养基：
A.普通糖发酵培养基
蛋白胨1.0g
氯化钠0.5g
所需糖、苷或醇类物质0.5-1.0g
1.6％溴甲酚紫酒精溶液0.1ml
蒸馏水100ml
取蛋白胨、氯化钠和水，混合加热熔解，调整pH为7.6，再加热10min。加入1.6％溴甲酚紫指示剂后，将上述的蛋白胨液分成若干份，如需要4种糖，就分成4份，分别加入各种糖。待糖溶解后，分装于有倒立发酵管的小试管内，每管液体要高于发酵管，如无发酵小管，可用半固体糖发酵培养基代替。加上塞，包装好，115℃蒸气灭菌20min，取出后既可应用。
B.厌氧菌糖发酵培养基
蛋白胨2.0g
氯化钠0.5g
硫乙醇酸钠0.1g
所需糖、苷或醇1.0g
琼脂0.1g
1.6％溴甲酚紫酒精溶液0.1ml
蒸馏水100ml
除指示剂外，各成分加热熔解后，调整pH值为7.2～7.4，加入指示剂，分装试管，经115℃灭菌20min。
另外，厌氧菌的糖发酵试验亦可用普通糖发酵培养基，接种后应放在厌氧环境中培养。
C.血清半固体糖发酵培养基
0.3％肉膏（pH7.6）100ml
琼脂0.3g
所需糖、苷或醇0.5～1.0g
0.5％酸性复红2ml
兔血清或小牛血清10ml
取肉膏汤lOOml，加入琼脂，煮沸熔化后，加入糖及指示剂，115℃灭菌20min。待培养基冷至50℃，加入已经56℃30min灭活的兔血清lOml，分装于无菌试管，无菌检查后备用。
1.1.3试验方法：取18-24h的试验菌接种于培养基中，置37℃培养1—7d，多数细菌在24h即可观察结果。指示剂由紫色变为黄色，这表示糖类发酵产酸，以”+”表示。若试管内倒置的小管内同时有气泡出现，则表示产酸和产气，以“？”表示；若指示剂颜色未改变，则表示对糖类不发酵，以“-”表示。
半固体糖发酵培养基作穿刺接种，除观察产酸和产气外，尚可观察细菌的动力。
1.2葡萄糖代谢型测定：又称葡萄糖氧化-发酵试验、O/F试验、H/L试验
1.2.1原理：氧化型的细菌是在有氧时分解葡萄糖，无氧时不能分解；发酵细菌是在有无氧时都能分解葡萄糖；产碱型细菌是在有无氧的情况下都不能分解葡萄糖，或产生碱者呈深紫色。
1.2.2培养基：蛋白胨0.2g
氯化钠0.5g
磷酸氢二钾（K2aPO4）0.03g
葡萄糖1.0g
琼脂0.5g
蒸馏水100mL
1％溴麝香草酚蓝水溶液0.3mL
除指示剂外，溶解以上各成分，调整pH值为6.8～7.0，加入指示剂，分装试管，经115℃灭菌20min。
1.2.3试验方法：将试验菌穿刺接种，每株菌接4支，其中2支用无菌石蜡（约0.5～1cm厚）封盖，以隔绝空气为闭管（厌氧）。另2支不加石蜡为开管（需氧）。同时设有不接种的闭管作对照。经37℃培养1、2、4、7d后观察，氧化型产酸者仅开管产酸；发酵型产酸者，则开管和闭管均产酸。如产气则在琼脂柱内产生气泡。开管闭管均不产酸者为产碱型。
1.3葡萄糖酸盐的氧化试验
1.3.1原理：假单胞菌和肠道杆菌科的细菌，可氧化葡萄糖酸为2-酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸无还原性基团，氧化后形成酮基，则可将斐林试剂中蓝色的铜盐还原为砖红色的Cu2O沉淀。
1.3.2试剂：
pH7.2的磷酸缓冲液
斐林试剂：甲液：结晶硫酸铜34.64g
蒸馏水加至500ml
乙液：酒石酸钾钠173.0g
氢氧化钾125.0g
蒸馏水加至500ml
使用时将甲液和乙液等量混合，当日使用。
1.3.3试验方法：用pH7.2的磷酸缓冲液配制含有1％的葡萄糖酸钠（或葡萄糖酸钙）溶液，分装于刻度试管，每管2ml。取试验菌18～24h的菌苔加入盛有2ml l％葡萄糖酸钠液试管至3ml，制成混悬液，置30℃过夜，每管加0.5ml斐林试剂。放入沸腾的水浴中加热10min，试管中液体由蓝色变为黄绿、绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反应，不变色者为阴性。
1.4甲基红试验（M·R试验）
1.4.1原理：M·R试验是测定细菌分解葡萄糖产酸的程度。若所产生的酸足以降低pH值到4.2或更低，此时加入甲基红指示剂呈红色。甲基红变色范围为pH4.4红色至pH6.0黄色。
1.4.2培养基：蛋白胨0.7g
葡萄糖0.5g
磷酸氢二钾0.5g
蒸馏水100mL
各成分溶解后，调整pH值为7.2～7.4。
1.4.3试剂：甲基红0.02g
95％酒精60ml
蒸馏水40ml
分装试管。经115℃灭菌20min后备用。
先将甲基红研磨溶解于酒精中，再加蒸馏水即成。
1.4.4试验方法：将试验菌接种培养基中，37℃培养48h。取少量培养液于另一小试管中，并加几滴试剂，如培养液呈现红色，则甲基红试验为阳性；黄色者为阴性，仍继续培养4—5d再进行试验。
1.5维培二氏试验（VP试验）
1.5.1原理：某些细菌能分解葡萄糖产酸，并将酸转化为乙酰甲基甲醇或2，3－丁稀二醇等中性物质。若在其中加碱并充分振荡，两种物质可被氧化为二乙酰，它再与培养液中的胍基结合生成红色化合物。
1.5.2培养基：同M·R培养基。
1.5.3试剂及方法
A.Barritt，s试剂法：甲液：6％a-萘酚酒精溶液。
乙液：40％氢氧化钾溶液。
取M·R试验的同一培养物约2ml，加入甲液lml，乙液0.4ml，充分混合，观察结果。
B.O，Meara，s试剂法：
氢氧化钾（或氢氧化钠）40.0g
肌酐（Creatine）0.3g
蒸馏水100ml
取上述同一培养物约2ml，加等量试剂充分振荡试管混匀。
C.硫酸铜试剂法
硫酸铜1.Og
浓氨水40ml
10％氢氧化钾960ml
硫酸铜溶于40ml浓氨水中，加10％氢氧化钾即成。试验时加等量的试剂于培养物中混合。
上述几种方法，在5min内呈粉红色反应为阳性；如为阴性反应，置37℃4h后，再行观察。
1.6.淀粉水解试验
1.6.1原理：许多产生淀粉酶的细菌，能把培养基中的淀粉水解为无色糊精等小分子，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不呈现蓝色。
1.6.2培养基：营养琼脂（pH7.2～7.4）100ml
可溶性淀粉0.2g
装入三角烧瓶，经121℃灭菌20min。
1.6.3试剂：鲁格（Lug01）氏碘液（见革兰氏染色法）。
1.6.4试验方法：将培养基熔化后，冷至50℃左右，倒成平板，凝固后，取试验菌点种于平板上，每皿可点种3—5个菌株，37℃培养48～72h。形成菌落后，在平板上滴加鲁格氏碘液，必须以铺满菌落周围为宜。菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，平板仍呈蓝色。