3.细菌的染色过程
3.1细菌抹片的制备
3.1.1玻片准备：载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有残余油渍，可按下列方法处理：①滴上95%洒精2—3滴，用洁净纱布擦拭，然后在洒精灯上轻轻拖过几次。②若上法仍未能去除油渍，可滴上1—2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在洒精灯火焰上轻轻通过。
3.1.2抹片：依所用材料情况不同，抹片方法也有差异。
3.1.2.1组织脏器抹片的制作。用镊子夹持脏器局部，以灭菌或洁净的剪刀剪取一小块，将其新鲜切面在载玻片中部表面轻轻压印或轻而迅速涂抹。
3.1.2.2血片的制作。取载玻片一张，将血液一小滴（米粒大小）滴于载玻片的一端，左手拇指与中指中指持载玻片的两端，右手持推片（选用边缘光滑平整的载玻片）与血滴接触后，轻微向左右移动，使血滴沾附推片与载片之间，形成300—400角向前推进涂抹，使之涂成薄薄的一层血膜。如蘸取的血液过多，必须将推片提前，在血滴的前方再接触载玻片，等血液扩散后再向前推进涂抹。涂抹时推片与载片之间角度要适当，推进速度适中，用力均匀，并要一推到底，中间不能停顿。血膜的长度最好不短于载玻片的1/3，载玻片的两侧应留有空隙。良好的血片必须薄而匀，对光观察有荧光。
3.1.3培养物抹片的制作。
3.1.3.1固体培养物抹片的制作用灭菌的接种环取一滴生理盐水置载玻片中央，后以左手持培养瓶或试管，底（管底）握于手中，右手拇指、食指、中指执接种环柄，将接种环在酒精灯火焰灭菌，然后将烧灼的接种环放在管口冷却一下再蘸取培养物少许，同样将管口通过火焰灭菌后，塞好塞子，放于架上。最后将接种环上的培养物置载玻片上的生理盐水中混匀，涂成小手指大、厚薄适宜的抹面，接种环进行烧灼灭菌。
3.1.3.2液体培养物抹片的制作用灭菌冷却的接种环取液体培养物1—2环置载玻片中央，然后涂成小手指大、厚薄适宜的抹即可。
3.2干操：上述抹片，应让其自然干燥。
3.3固定：有两类固定方法：①火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在洒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为度）进行固定。②化学固定：血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色，不用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2—3min，取出晾干；或在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2—3min后，自然挥发干燥。抹片如作瑞氏染色，则不必固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。
3.4染色：固定好的抹片，可以根据需要进行各种染色。
3.5镜检：将显微镜置于平坦、稳固的显微镜台上，装上玻片后，先用低倍镜观察，找到观察对象后将其移至视野的中央，然后换用高倍镜观察即可，必须使用油镜观察时，应注意防止压碎玻片。
4.常用的几种染色方法细菌染色方法很多，主要分为单染色法、复染色法和特殊染色法3种。单染色法是用一种染料将细菌及周围的物体染成一种颜色，如碱性美蓝染色法。复染法（鉴别染色法）是用两种以上的染料染色，可将不同细菌染成不同的颜色，除可观察细菌形态外，还能鉴别细菌，如革兰氏染色法和抗酸染色法。特殊染色法就是采用着色力强的染色剂、脱色剂、加热、加酸、加矾等显示细菌芽胞、鞭毛、荚膜等特殊结构的方法，如细菌芽胞染色法等。
5.染色液的配制及染色方法
5.1革兰（Gram）氏染色法
原理：有些细菌的胞浆膜中含有大的高分子核糖核酸镁盐，它在稀释碘液的作用下，可与结晶紫等碱性染料结合成稳定的，不易被酒精脱掉的紫色化合物，当用复红或砂黄等复染时，即不再着色，因此，这类细菌被染成紫色，称为革兰氏阳性细菌。另外，还有一种细菌的胞浆膜中由于没有高分子核糖核酸镁盐，虽然也能被结晶紫等碱性染料染上颜色，但不稳定，易被酒精脱掉，当用复红或砂黄等复染时，则又可被染成红色，称为革兰氏阴性细菌。
染色液的配制：
①草酸铵结晶紫染液：
溶液A：结晶紫（Crystal violet）2.0g
95％酒精20ml
溶液B：草酸铵（Ammonium oxalate）O.8g
蒸馏水80mL
混合溶液A和溶液B，静置48h后使用。
②革兰或鲁格尔（Lug01）氏碘液：
碘片1.Og
碘化钾2.0g
蒸馏水300ml
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分。
③95％的酒精溶液：直接用95％酒精，或95ml纯酒精加5ml蒸馏水混匀即可。
④沙黄复染液：
沙黄2.5g
95％酒精100mL
取上述配好的沙黄酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。
染色法：①涂片、自然干燥、火焰固定。
②滴加草酸铵结晶紫液染1～2min，水洗。
③滴加碘溶液1～3min，水洗。
④滴加95％酒精脱色约20～30s（直到不脱色为止），水洗。
⑤加石炭酸复红液或沙黄液复染0.5～lmin，水洗。
⑥吸干或自然干燥，镜检。
结果：革兰氏阳性菌为紫色，革兰氏阴性菌为红色。
5.2碱性美蓝染色法
染色液的配制：
溶液A：美蓝（Methylene blue）0.6g
95％酒精30mL
溶液B：KOH 0.01g
蒸馏水100mL
将配制的溶液A和B混合，滤纸过滤后备用，此液可长期保存。如欲获得多色性美蓝液，可将配好的美蓝液倾人大瓶中，松松地加以棉塞，每天振荡5min，时常以蒸馏水补足失去的水分，经过长时间（6～12个月）的保存，即可获得多色性。
染色法：①涂片、干燥、固定。
②滴加适量美蓝染液染色1～3min。
③水洗、干燥、镜检。
结果：菌体呈蓝色。久存的美蓝具有多色性，能将菌体染成蓝色，荚膜染成红色，此法也是最简单的荚膜染色法。
5.3碱性复红染色法
染色液的配制：
碱性复红1.0g
95％酒精lOOml
蒸馏水900ml
将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95％酒精，继续研磨使其溶解，静置24h，过滤加水即成。
染色法：①涂片、干燥、固定。
②滴加碱性复红染色液1～3min，水洗、吸干、镜检。
结果：菌体呈红色。
5.4瑞特（Wright）氏染色法
染色液的配制：
①瑞特氏染液：
瑞特氏染料粉末0.3g
甘油3ml
甲醇97mL
将染料粉末置于干燥的乳钵内研磨，先加甘油，后加甲醇，溶解后装棕色瓶中，放暗处，经7d过滤，保存备用。
②pH6.4的磷酸盐缓冲液：
磷酸二氢钾6.63g
无水磷酸氢二钠2.56g
蒸馏水1000mL
将上述药品溶于蒸馏水中即成。
染色法：此法适于染血片及组织片。
①涂片、自然干燥。
②滴加瑞特氏染液染lmin，使标本被其中甲醇所固定。
③加等量pH6.4的磷酸盐缓冲液（若无磷酸盐缓冲液用蒸馏水代替亦可）轻轻晃动载玻片，混匀静置5min。
④水洗、吸干、镜检。
结果：细菌被染成深蓝色。
5.5姬姆萨（Giemsa）氏染色法
染色液的配制
姬姆萨染料粉末0.5g
甘油33mL
甲醇33mL
先将姬姆萨染料粉末溶于甘油中，水浴加温55℃—60℃，经1～2h使充分溶解，再加入甲醇混匀，静置ld以上，滤过后置有色瓶中，临用时取上述配液lmL加蒸馏水10mL即成。
染色法：
①缓慢染色法。对于一般不易着色的微生物如螺旋体等最为适用。
涂片、自然干燥；滴加甲醇2～3滴固定2～3min；将固定片浸于盛姬姆萨染色液的缸中染16～24h或过夜；水洗、干燥、镜检。
②快速染色法。本法适于血片、组织触片等的染色。
涂片、自然干燥；用甲醇固定1～3min；待干后，用姬姆萨氏原液1份加蒸馏水20份，新制成的混合液染色30～60min；再用蒸馏水充分冲洗约半分钟，自然干燥或吸干后，镜检。
结果：细菌呈蓝青色，组织、细胞等呈其他颜色，视野常呈红色。
5.6荚膜染色法
5.6.1美蓝染色法：抹片自然干燥，甲醇固定，以久储的多色性美蓝液作单染色，荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。
5.6.2瑞特氏或姬姆萨染色法：涂片自然干燥，以瑞特氏或姬姆萨氏染色液染色，荚膜呈淡紫红色，菌体呈蓝色。
5.6.3奥尔特（olt）氏荚膜染色法：
染色液的配制：
沙黄3.0g
蒸馏水100mL
取沙黄于乳钵研磨，徐徐加水溶解即成。
染色法：涂片，自然干燥，加热固定；滴加3%沙黄染色液，并加热至产生蒸汽后，继续染3min；水洗、干燥、镜检。
结果：菌体呈红褐色，荚膜呈黄色。
5.7芽胞染色法用复红美蓝芽胞染色法。
染色液的配制：
①石炭酸复红液：
碱性复红酒精饱和液10mL
5％石炭酸液90mL
两液混合即成。
②95％的酒精。
③碱性美蓝液。配制见碱性美蓝染色法。
染色法：
①涂片、干燥、固定。
②滴加石炭酸复红溶液并加热使蒸汽出现5min，冷却后水洗。
③用95％酒精脱色2min，水洗。
④滴加碱性美蓝液复染lmin，水洗、干燥、镜检。
结果：菌体呈蓝色，芽胞呈红色。
5.8鞭毛染色法
5.8.1莱佛逊（Leifson）氏鞭毛染色法：
染色液的配制：
钾明矾饱和水溶液20ml
20％鞣酸水溶液lOml
蒸馏水lOml
95％酒精15ml
碱性复红饱和酒精溶液3ml
依上列次序将各液混合，置于紧塞玻瓶中，其保存期为7d。
菌液制备：先将细菌接种在潮湿的平板上，培养6h，取爬行最前的细菌，接种到另一新平板上培养，反复3-4次，最后一次培养6～8h，轻轻刮取爬行前面的细菌，放在蒸馏水中，呈轻度混浊，然后，每毫升菌液中加0.1～O.2mL甲醛后制片；或用半固体培养基传代几次后，再接种到肉汤培养基中，取其生长表面的菌液直接制片。
染色：按上述方法制成标本片后，加上莱佛逊氏鞭毛染色液，在25℃～37℃下，染色10～15min，水洗后干燥，镜检。
结果：鞭毛、菌体均为红色。
5.8.2银染法：
染色液的配制：
A液：鞣酸20.0g
蒸馏水lOOml
取鞣酸加蒸馏水，在50℃的水浴中混合溶解，备用。另外配制6％的三氯化铁溶液，临用前将两液等量混合。
B液：硝酸银2.0g
蒸馏水lOOml
将硝酸银溶于蒸馏水中。取出5～10ml作为回滴用，其余的硝酸银溶液用10％NH30H滴至出现沉淀，继续滴加NH30H，使沉淀消失。当溶液刚一澄清时，就用留下的硝酸银回滴，使其发生沉淀，再滴则沉淀消失，再滴则又有轻微而稳定的雾状沉淀为宜。
菌液制备：同上。
染色：取清洁无油的载玻片，加1～2环上述菌液，轻轻涂于载玻片表面，自然干燥后，置蒸馏水中浸泡1min，干燥后加A液数滴，O.5min后用蒸馏水冲洗，自然干燥后，加液数滴，加温使产生蒸气，维持lmin，蒸馏水洗，干燥后镜检。
结果：菌体深褐色，鞭毛褐色。
5.8.3刘荣标氏鞭毛染色法：
染色液的配制：
A液：5％石炭酸溶液lOml
鞣酸粉末2.0g
饱和钾明矾水溶液lOml
B液：饱和结晶紫或龙胆紫酒精溶液。
用时取A液10份和B液1份混合，此混合液能在冰箱中保存7个月以上。
菌液制备：同上。
染色：用上述方法制成标本片后，加上A、B混合液，室温中染色2～3min，水洗、镜检。
结果：菌体、鞭毛均呈紫色。
5.9异染颗粒染色法
5.9.1美蓝染色法
美蓝染色液：见碱性美蓝染色法的染液。
染色法：涂片、干燥、固定；滴加多色性美蓝液染色30～60s，水洗、干燥、镜检。
结果：异染颗粒呈淡红色，菌体为深蓝色。.
5.9.2奈瑟氏（Neisser）染色法
染色液的配制
甲液：美蓝0.1g
95％酒精2ml
冰醋酸5ml
蒸馏水95ml
按上述次序序溶解，混合过滤即成。
乙液：俾斯麦褐（俗名俾斯麦棕）O.2g
蒸馏水lOOml
将蒸馏水加热至100℃，加入俾斯麦褐溶解，过滤待用。
染色法：涂片、干燥、加热固定；滴加甲液染30～60s，水洗；滴加乙液染30s，水洗、干燥镜检。
结果：异染颗粒呈深紫色，菌体为黄褐色。
5.10抗酸染色法
5.10.1萋-尼（Ziehl-Neelsen）氏抗酸性染色法
染色液的配制：
石炭酸复红液：碱性复红5.0g
结晶石炭酸5.Og
95％酒精50mL
蒸馏水500mL
取碱性复红、结晶石炭酸加入酒精中，于温水浴中进行溶解，然后加蒸馏水，使用前过滤。
3％盐酸酒精：95％酒精97ml
浓盐酸3ml
二者混合摇匀即成。
0.5％美蓝水溶液：见碱性美蓝染色法。
染色法：涂片、干燥、固定；滴加石炭酸复红液于涂片上，置载玻片于火焰上，加热微温至产生蒸气（不要沸腾），并保证染色5min（染色液蒸发减少时，应随时添加），冷却后用水冲洗；3％盐酸酒精脱色30～60s，水洗；O.5％美蓝液复染lmin，水洗、干燥、镜检。
结果：抗酸性细菌呈红色，其他菌或细胞呈蓝色。
5.10.2Pooman氏染色法
染色液的配制：石炭酸复红液和l％美蓝酒精液：分别见石炭酸复红染色法及碱性美蓝染色法染液。
染色法：涂片、干燥、固定；滴加石炭酸复红液染色lmin，水洗、干燥；用1％美蓝酒精液复染20s，水洗、干燥、镜检。
结果：与萋-尼氏抗酸性细菌染色法判定方法相同。