菌种的保存方法及保存期因菌种的不同而有差异。益生菌为专性或兼性厌氧菌，保存时应根据菌种的生长特点选择合适的方法。
（1）传代培养保存法，又称为定期移植保存法。该法是将生长于适宜培养基上的、处于对数生长期后期的细胞放于低温处保存的方法，从而使菌细胞生长延缓或维持最低的基础代谢。所用的培养基因菌种的不同而有差异，应根据该菌种在此条件下保存的不同存活期限进行定期移植。
（2）冷冻保存法。该法是将所保存的菌种分散于保护剂中，并使其立刻处于低温冻结状态。此法操作简单，只要有冰箱即可，可保存几年。常用保护剂有去纤维羊血、20％脱脂乳、7.5％葡萄糖血清等。
（3）冷冻干燥法，又称为冷冻真空干燥法、冻干法。其利用的原理是当微生物处于低温、隔绝空气和干燥的条件下时，其生命活动处于休眠状态。该法是将所保存的菌种分散于保护剂中，并使其处于低温冻结的真空条件下，冰升华而使菌体干燥。保护剂可防止因冻结的水分升华对细胞的伤害，常用的保护剂有10％脱脂乳、7.5％葡萄糖血清、含0.1％谷氨酸钠的10％乳糖溶液等。该法可保存菌种10～20年。
（4）液体石蜡覆盖保存法。该法是将被保存的菌种移植到其适宜培养基中，再用无菌液体石蜡覆盖1厘米左右，培养后在室温下暗处或0℃～5℃下保存。
以上为常用的一些方法，另外，还有明胶片干燥保存法、液氮超低温保存法等。