所谓孢子分离法是把灰树花成熟的有性孢子接种在同一培养 基上，让其萌发、自由交配来获得纯菌种的方法。孢子分离 法因所利用孢子的数目不同，又分为多孢子分离和单孢子分 离两种。一般来说，多孢子分离所获得的纯种基本上能形成 子实体，且方法易学，分离较易成功，在生产上经常采用， 不过仍应做出菇试验后才能用于生产。单孢子分离一般用于 培育优良新品种，且操作比较复杂，必须要有熟练的技术和 设备方可进行。因此，在制种时一般多采用多孢子分离法， 其操作方法如下。
（1）种菇挑选。种菇即分离材料，对种菇进行挑选是菌种分 离中的重要环节，必须从高产、稳产、适应性强的优良品系 群体中，严格挑选出菇形、商品性好，外表清洁、无病虫害 、出菇早、菌柄短、七八分成熟的灰树花子实体做种菇。采 摘后放入灭过菌的纸袋内，带回接种室。
（2）器皿消毒。首先应将所用的分离器皿（烧杯、玻璃罩或 三角瓶、培养皿、剪刀、接种针、镊子、解剖刀、不锈钢钩 、纱布）一起置于高压灭菌锅内进行消毒灭菌，并准备好无 菌水。然后连同酒精灯、消毒药品、制作备好的三角瓶或试 管培养基和分离器皿，以及经处理的种菇等，放入接种箱（ 室）内。用紫外线灯照射45分或用气雾消毒剂熏蒸30分或同 接种箱使用灭菌，才可按无菌操作进行分离。
（3）无菌处理。在接种箱（室）内，用镊子夹住种菇，放入 70％酒精液或0.1％升汞溶液内浸3～5分，以杀死种菇表层上 的杂菌。捞取后用无菌纱布吸干，置于消毒后的培养皿中备 用。
（4）孢子采集。将经无菌处理的种菇切取一部分或不切取， 用不锈钢钩钩住，挂入三角瓶的正中，距离培养基表面2～3 厘米，并塞好棉塞，静置24小时之后会发现有大量的孢子弹 落于培养基上，形成一层孢子印。图9孢子采集法（5）接种培养。在接种箱内，用接种针挑取少量的孢子，放 入装无菌水的三角瓶中，摇动制成孢子悬浮液。再用接种针 蘸取一滴孢子悬浮液，涂布于斜面培养基或在培养皿的平板 上画线接种。然后适温培养，待孢子萌发成菌落时，筛选萌 发早、生长快的菌丝进行转管培养。8～12天后白色菌丝可长 满整个试管培养基斜面，即得原始母种。图10平板画线接种1.平板画线2.孢子萌发
3.移入试管培养基内培养