（1）按配方称取葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、酵母、麦芽汁等易溶物质后置于烧杯中，加入适量水溶解。
（2）将马铃薯去皮、称量后，用小刀切成薄片，放入铝锅中，锅内加水1300毫升，加热煮沸15~20分钟，使马铃薯熟而不烂为宜。
（3）用2层纱布过滤马铃薯汁液，在滤液中加入琼脂，继续加热至琼脂完全溶化。加热期间要不断地搅拌，防止溢锅或焦底，一般需15~20分钟。
（4）琼脂完全溶化后，加入易溶物质的水溶液，充分搅拌均匀，补足水分到1000毫升，用2层或4层纱布滤去杂质。
（5）趁热分装试管。因琼脂极易凝固，所以在分装过程中要注意培养液的保温。分装用的试管多采用18毫米×180毫米的玻璃试管，保存用的培养基可用20毫米×200毫米的试管。每管装入量为试管长度的1/5~1/4，一般8~10毫升。分装时注意装量均匀，尽量避免培养液附着于管口，以免粘住棉塞造成污染。
（6）分装好的试管要加上棉塞。棉塞要用普通棉花制作，不能用脱脂棉。棉塞的大小、松紧要合适，塞入长度占棉塞长度的2/3，松紧度以手捏棉塞可提起整个试管为宜。
（7）培养基灭菌。一般常采用手提式高压灭菌锅灭菌。加装好棉塞的试管用小布袋分装好，上面用牛皮纸包扎好，用细绳捆紧，竖直放入手提式高压锅的内桶里。操作规程可参考高压蒸汽灭菌。
（8）摆斜面。取出装试管的小布袋，解开牛皮纸，当培养基温度降至60℃左右时，及时将试管摆成斜面，使培养基的长度为试管总长度的1/2左右。培养基温度太高时，摆成的斜面冷凝水太多，易滋生杂菌；温度太低时，培养基过快凝固，难以摆成斜面。摆放时要注意试管的斜面要均匀一致，防止长短不一。试管冷却1天后即可收起，以备母种的转扩用。