这是金针菇整个制种过程中的关键环节，它关系到原种、栽培种的质量好坏和产量高低，必须认真进行分离、纯化、筛选和鉴定。
（1）母种的分离。金针菇母种的分离方法有孢子分离和组织分离两种。
其一，孢子分离法。孢子分离法是用金针菇孢子萌发产生菌丝培养母种的方法。孢子分离法可分单孢分离和多孢分离两种，一般生产用种多采用多孢分离法。
进行孢子分离之前，需先挑选种菇。种菇应是菌丝生长健壮，无病虫害，生长好，出菇整齐，产量高并具有该品种典型特征的子实体。选取留一小段菌柄的菌盖，用75％的酒精将子实体表面消毒。然后放入事先已灭过菌的有滤纸的培养皿内，放置一昼夜，把菌盖取出，孢子就弹射在纸上成白色的孢子印。再用灭过菌的接种针先端沾一点PDA培养基，迅速用它沾一下孢子粉随后移到PDA培养基上，一般移30管以上。上述操作均必须在接种箱或超净工作台上进行，接种后置于22℃～25℃下培养，经过7～10天，在培养基表面可看到白色绒毛状菌丝。选其中菌丝生长整齐，无污染的1支试管及时挑取菌落转管培养，经过连续3次以上的纯化，保留菌丝生长健壮，无污染的试管作为出菇栽培试验用种。
其二，组织分离法。组织分离是采用金针菇子实体组织培养成菌丝体的方法，不需要再经过性细胞结合。方法简便，菌丝生长发育快，能保持原来的菌种特征，但生活力不如孢子分离法获得的菌丝强健。图8斜面试管的摆放
图9斜面试管的摆放
组织分离法首先选取优质、具有该品种典型特征的种菇，在取种菇前一天即停止喷水，把采下来的菇体表面用75％酒精消毒后，在无菌条件下从菌盖的下方把菌盖去掉，用灭过菌的镊子或解剖刀将菌柄与菌盖之间的组织取下移到PDA斜面培养基上（图8）。一般要在22℃～25℃下培养，每天检查1次。如有杂菌污染或菌丝生长不良的试管应及时捡出。经过7～10天后，挑选菌丝生长整齐、健壮，无污染的转管、纯化，连续纯化3次以上，保留菌丝生长健壮的斜面试管备用。
上述两种方法获得的纯菌种，必须经过反复栽培试验，确认是优良菌株之后才能在生产上应用。
（2）母种的扩大培养。用上述两种方法获得的母种，或是直接由研究单位购买的母种由于数量少，所以在生产中需扩大繁殖才能满足生产上的用种。由母种扩大繁殖后的试管菌种仍是母种，或称其为再生母种。再生母种不宜多次转管，以免菌种生活力下降，影响产量和菇的质量。母种的扩大繁殖必须在无菌条件下按规程操作（图9）。