双孢菇为低温恒温出菇型菇类，原基形成不需要温差刺激，温度条件对双孢菇的影响主要是通过影响酶的活性实现的。
在不同生长发育阶段，双孢菇对温度的要求有所不同。在孢子萌发和菌丝体生长阶段，温度要求较高，而在孢子弹射和子实体形成和发育阶段，温度要求低一些。双孢菇孢子弹射的温度为18℃～20℃，超过27℃或低于14℃，即使子实体已经相当成熟，也不能散发孢子。双孢菇孢子萌发的适宜温度是24℃，温度过高过低都会延迟担孢子的萌发。双孢菇菌丝体生长的温度范围是5℃～33℃，5℃以下菌丝体生长极其缓慢，33℃以上菌丝体基本停止生长。菌丝最适生长温度为22℃～26℃，此时，菌丝生长速度快，粗壮浓密，生活力强。高于28℃，菌丝生长纤细无力；低于18℃菌丝短而浓密，但生长速度减慢。双孢菇菌丝较耐低温，不耐高温，在-20℃时菌丝也不会死亡，可以安全越冬。
双孢菇子实体生育的温度范围是4℃～23℃，最适温度为15℃～16℃。高于19℃子实体生长速度快，菌柄细长，肉质疏松，品质低劣，并易开伞。低于12℃生长速度慢，出菇稀少，菇大而肥厚，组织致密，单菇虽重而产量降低。
双孢菇为恒温出菇型菌类，出菇不需要温差刺激。而且，从菇蕾形成到子实体采收期间，温度只能下降，不可回升，否则将会造成营养倒流，子实体中的营养向菌丝体流动，导致菇蕾大批死亡。这一点在春季出菇管理时必须加以重视。