按照惯例，研究传染病，首先要找到致病的微生物，为了找到这种微生物，巴斯德甚至冒着生命危害，从狂犬的口中取出唾液，来进行试验。
1880 年12 月，一个5岁的小孩1个月前被疯狗咬伤，痛苦地死在医院里。巴斯德收集了小孩的唾液，将它与水混合接种兔子，不到36 小时，兔子就死了。把兔子的唾液再接种另一只兔子，这只兔也很快地死了。用显微镜检查死兔的血液，发现了一种微生物，用牛肉汁培养这种微生物，将菌液再次注射兔子和狗，毒力再度表现出来。检查这些动物的血液，看到了与培养物相同的微生物。
狂犬病的潜伏期通常是很长的。而从唾液中分离的病原菌致死作用很快。这引起了巴斯德对这种病原菌的怀疑，他猜想可能有一种微生物与狂犬病毒同时存在于唾液中。随着观察的病例越多，对这一假设就确信无疑了。
狂犬病的病原菌能侵入人和狗的脑部和脊髓。所以巴斯德用尽过去的各种方法培养病原微生物，分离不到病原菌。经过试验、研究，巴斯德肯定狂犬病是致病因子引起的，特别是在脑和脊髓中发病是这样的。如果用动物的脑作为培养基，也许会得到病原菌。
巴斯德的助手鲁设计了一种方法。将狗麻醉后，用环锯术打开狗的脑壳，接种一点疯狗的脑汁。经过两个星期，狗表现出狂犬病的症状并死去。这种方法被证明比用唾液接种更为准确。用脑接种法接种兔子和豚鼠，也都表现出狂犬病的症状。经过反复试验，巴斯德弄清了发病部位和病原的主要线索。
试验表明，狂犬病的病原微生物很小，它的离体培养不同于一般病原微生物。
后来科技进一步发展，知道狂犬病的病原是病毒。
巴斯德用环锯术接种兔子，兔子瘫痪了。用瘫痪兔子的脑接种狗的脑部，狗虽然表现出轻度的症状，但不久又复原了。几个星期后，用毒力强的脑再次接种这些狗。如此反复多次在200 多次试验中，发现有几只狗没有发病。
于是，巴斯德便开始研究狂犬病病原的减毒试验。
像以前用兔子连续传代接种，以得到减毒的疫苗一样，得到23 只狗能抵抗狂犬病病原的攻击。可是，这种疫苗如何用于人身上仍然有待于解决。巴斯德和他的助手，用狗脑接种猴子，从猴子再接种猴子。经过连续接种，得到了一系列毒力不同的病原菌。后来用兔子和豚鼠做的试验，也可以得到同样的结果。可是，用这种疫苗免疫狗的效果还不够好。
巴斯德和助手用0℃—12℃的低温进行减毒试验。他的助手鲁提出用干燥空气进行减毒的新方法。把严重感染的兔子的脊髓用线吊在消过毒的瓶子里，瓶底放一些氢氧化钾吸收空气中的水分，瓶口塞上棉花以防空气中的尘埃，试验瓶子放在25℃房子里。随着放置时间的延长，脊髓便逐渐干燥，毒力也逐渐减弱。到了第14 天，毒力便完全消失。巴斯德和助手把无毒的脊髓磨碎，加入无菌水，给50 只狗做皮下接种，第二天用干燥13 天的脊髓接种，以后逐渐提高毒力，最后用当天病死兔子的脊髓接种。一个月后，试验的50只狗都生活得很正常。另用未经免疫的狗直接接种强毒力的脊髓，狗都患病死去。
成功了！巴斯德制成了狂犬疫苗。
这种疫苗能用来治疗人的狂犬病吗？巴斯德没有把握。
1885 年7 月6 日，一名来自阿尔萨斯省的孩子约瑟夫·美斯特，被疯狗咬了14 处伤口，已经两天了，孩子的母亲把9 岁的孩子带来找巴斯德，要求他救救她的孩子。
能否救活这个孩子？巴斯德没有把握。在征求医生和生理专家的意见后，巴斯德接受了治疗的要求，决定用干燥减毒的“疫苗”（脊髓制成的液体）进行治疗。他先给美斯特注射保存14 天的疫苗，随后一天一次。第一次注射之后一周，巴斯德在日记中写道：“一切正常，这个孩子睡眠好，胃口好，疫苗一天比一天能吸收，而且没有一点后遗症。”7 月16 日，巴斯德给小美斯特施行最后一次注射。这一次要用毒性最强的狂犬疫苗。
这一夜，巴斯德根本没睡。这是他一生中最犹豫难过的一夜。有免疫力的小美斯特到底耐得住这种病毒吗？美斯特会得救吗？会不会死去？ 第二天，当巴斯德见到小美斯特仍然健康如常，欢蹦跳跃的跑来找他时，他满脸泪水，紧紧地抱着小美斯特亲吻，激动地说：“孩子，你的病治好了！”
经过1个月的观察，美斯特一直没有出现狂犬病的症状。少年从巴斯德的研究室出来，安然无事的回阿尔萨斯去了。
1885 年10 月26 日，巴斯德宣布，一个星期之前他又治愈了一个叫朱皮利的放羊孩子的狂犬病。
自此以后，被疯狗咬伤的病人从各地来到巴黎治疗。有的来自俄国，有的来自美国。巴斯德精心地为他们治疗。1885 年11 月起，到1886 年2 月底止，巴斯德治疗350 人，只有一名少女是被疯狗咬伤37 天后已经发病才接受治疗，结果不治死亡。
巴斯德在1886 年向法国科学院报告了治疗狂犬病的效果，并建议在巴黎建立一个专门的研究狂犬病的免疫机构。巴斯德希望这个机构不求国家援助，采用募捐方式。科学院采纳了他的建议，成立了委员会着手募款。这个研究机构除了治疗狂犬病以外，同时作为传染病的研究中心，并决定命名为“巴斯德研究所”，巴斯德任所长。
募捐活动在法国国内和国外同时进行。俄国沙皇为了感谢巴斯德治愈了俄国的狂犬病人，委派他的弟弟拉迪米尔大公送给巴斯德一枚俄国圣安娜十字勋章，捐赠10 万法郎给巴斯德研究所。巴西皇帝和土耳其国王也捐了款。
共收到捐款258 万多法郎。法国国会又拨款20 万法郎作为建立该研究所的基金。巴斯德全部工程费用为156 万多法郎，剩余的100 多万法郎赠给巴斯德研究所。巴斯德和他的助手鲁、尚贝朗同意把出售狂犬病疫苗的权利献给研究所。
1888 年，众之所望的巴斯德研究所竣工了，11 月14 日在新落成的研究所图书馆举行了落成典礼。法国总统、政界领袖、政治家、科学家、巴斯德的友人和学生们都来参加。典礼上详尽报道了巴斯德的伟大贡献和成就。友人格兰谢博士讲述巴斯德辉煌功绩时说道：“正如各位所知道的，巴斯德先生是科学界的革命家，他那创造性的想象力，由严密观察所得的事实，证明其正确无误。就这样，巴斯德先生击倒了许多错误的理论和知识，代之以他所建立的新的科学。关于酵母以及传染病因的微生物的发现和预防接种的发明，对于化学、兽医学以及人类医学是一种根本的革命。” 巴斯德由于在1887 年10 月23 日再次脑溢血发作，舌头麻痹，由任职外交官的儿子代为朗读演说词。巴斯德在答谢辞中说：“如果说科学没有国界，那么科学家却应该有祖国，如果你的工作在世界上产生了影响，应该把这种影响归功于祖国。”
七十寿辰
1892 年12 月27 日，巴斯德70 岁。
5 月时，丹麦、瑞典和挪威成立了委员会，筹备庆祝他的七十寿辰。11月，法国科学院内科和外科学部组成募捐委员会，以示对巴斯德的敬意。
12 月27 日，法国政府为巴斯德举行了盛大的生日庆祝会。会场上坐满了学院院士、大学教授、政府官员等各界名人以及各国的代表，还有巴斯德的助手和学生。
上午10 时半，在乐队奏乐声中，巴斯德在法国总统卡尔诺搀扶下进入会场。总统引导巴斯德到台上正中央坐下，接受法国各界以及外国代表的祝贺。
科学院长赠送的纪念品是表面雕刻巴斯德侧脸的金牌，背面铭刻：“奉呈巴斯德，恭贺70寿诞，满怀感谢的法国以及全体人类敬赠。” 最先实行杀菌法的李斯特代表英国出席庆祝会，他在祝贺词中说：“你为世人揭开了传染病的黑幕！” 李斯特说完，巴斯德站起来和这位因科学而结识的异国朋友互相拥抱。
巴斯德感动得颤抖着，心想：“能受到如此隆重盛大的生日庆典的学者，恐怕不多吧！伟大的科学家中，不能目睹自己的胜利而寂寞地死去不乏其人，与那些人相比，能亲见自己的胜利的我，是何等幸福啊！” 一生朝气蓬勃、声音洪亮的巴斯德，这时因半身麻痹症加剧，说话小得像蚊子叫了。他的答辞是由儿子说的，他在答辞中说：“首先要扪心自问，我在学习上作了些什么？随着日益长进，自问我为祖国做了些什么？终有那一天，当你想到自己在某些方面为人类进步、为人类福利作出了贡献，你们会感到无比幸福。” 在巴斯德的教导下，他的学生也积极从事解除人类痛苦的研究。鲁对危害儿童的白喉进行了研究。鲁发现白喉是由一种作用很强的有毒物质引起的，是在微生物生长发育时产生的。鲁从免疫的马血中得到抗白喉毒素，使白喉病人的死亡率由以前的51％，降为24％。在中国香港发生鼠疫时，巴斯德的学生耶尔森到那里研究鼠疫。耶尔森发现了鼠疫杆菌。根据试验，耶尔森得出结论，鼠疫是一种传染病，主要传染媒介是老鼠。
1895 年6 月13 日，巴斯德去威尔涅甫休养，希望在那里能恢复自己的健康。这个夏天，他坚持读书，坚持和助手讨论防治白喉。可是，他的麻痹症不断加重，说话也一天比一天困难了。
9 月27 日，家人弯下身请他喝牛奶的时候，他以虚弱无力的声音说：“什么都不要。”他的眼神显露出告别的表情。他的头沉入软枕中，身体完全麻痹，两眼紧闭动都不动。
第二天凌晨4 时40 分，巴斯德与世长辞，终年73 岁。
法国政府以隆重的国葬仪式来送别这位伟大的科学家。
巴斯德是一位伟大的科学家。他屡次接受政府的委托，研究他不懂的课题，为发展法国的养蚕业、制酒业与畜牧业作出了重大贡献。英国生理学家赫胥黎在英国皇家学会上说：“仅是巴斯德作出的发现，就足以抵偿法国于1870 年付给德国50 亿马克的战争赔款。巴斯德为科学、为祖国、为人类辛勤奋斗了一生。”