一天，在弗莱明主持下，医生以近乎万无一失的方式，进行了消毒灭菌，用抗菌剂对伤员的伤口做了外科处理，大家一致以为不会出现伤口感染。可是，几天之后竟有一些伤员因伤口感染、化脓而死去，这使弗莱明异常震惊。从此弗莱明把注意力集中到给伤员敷用的抗菌剂本身上了，经过精心的观察和反复实验，弗莱明找到了罪魁祸首。原来，当时医疗所用的抗菌剂，事实上是“有毒”的，为此他发明了用来给新的抗菌剂评估的试验方法，他们的工作非常出色，弗莱明所在的战地医院成为防止伤口感染最佳医院。战争结束了，弗莱明又回到了赖特接种站，从事他心爱的研究工作。战争使赖特接种站的伙伴们减少了，但战后重建工作又为站里增添了新生力量。不久，艾利森大夫成了弗莱明的助手，两人配合默契，工作很有成效。
1921年，弗莱明和艾利森发现了溶菌酶。溶菌酶是一种大量分布在动植物组织中、能够溶解病菌的生物酶。当时，弗莱明和助手正在做一项生物培养抗菌试验。当弗莱明观察培养液时，培养液板恰好被一种十分稀少的生物孢子污染。机遇偏爱有准备的头脑，这种偶然的现象一下子把弗莱明的注意力吸引到早先并不认识的具有溶菌作用的酶上。他同艾利森一起对溶菌酶开展试验研究，为后来发现盘尼西林奠定了基础。弗莱明和他的助手研究了7年溶菌酶，本以为它能够成为一种重要的疫苗或有效的药物，然而，可以说他们的目的没有达到。这是因为溶菌酶在病原生物方面几乎丝毫不起作用。科学研究总是面临成功与失败，而且失败的总量总是大于成功的总量，失败固然可惜，但宝贵的经验却是千金难买的，没有失败经验的人，不可能尝到成功的甜头。
事实上开了通向盘尼西林的大门。1922年他在做实验时，发现了一种他称之为溶菌霉的物质。溶菌霉产生在体内，是黏液和眼泪的一种成分，对人体细胞无害。它能够消灭某些细菌，但不幸的是在那些对人类特别有害的细菌面前却无能为力。因此这项发现虽然独特，却不十分重要。
1928年夏天酷热难当，赖特生物研究中心破例放一个避暑假，同事们都跑向海滨避暑胜地或一切清凉宜人的地方。几天来的连续失败使弗莱明的心情格外烦躁，他胡乱地放下手中的实验，也准备去海滨避暑。天气热得有点透不过来气来，什么事也干不下去的弗莱明，望着实验台上杂乱无章的器血，心想，这在20多年的科研生涯中还是第一次。从前，细心的弗莱明可不是这个样子的。
9月的天气渐渐凉爽下来了，人们也心平气和地陆续回到赖特研究中心了。弗莱明回到实验室，观察他度假之前搁放在工作台上的一堆盛有培养液的表面皿。他望着生毛发霉的试验器皿有些追悔莫及，应该在度假之前就把这些东西收拾好，他丢弃了这些不能再用的东西。过了不久，弗莱明重新取回其中的一些器皿，作进一步的观察。其中一个试验皿经过第二次仔细检查之后，显现出这样一种现象：靠近一团霉菌的一些葡萄球菌落，明显地被溶解掉了。也许这时弗莱明脑子里已经有了溶菌酶的概念，特别是经历失败的宝贵经验，他决定将这些菌落进一步培养观察，并作进一步深入的研究，于是发现盘尼西林的历史开始了！
10月30日，弗莱明在自己的笔记本上第一次记录了有关霉菌试验的情况。弗莱明将霉菌菌落在常温下放在盘中培养了5天，再将其他多种生物培养液以条状穿过菌落，然后再用培养液加以培养。他把结果记录下来了：“某些生物体直接朝霉菌生长，甚至越过并覆盖住了霉菌；而葡萄球菌却在霉菌前2.5厘米处停下了。”在随后的一次试验中，弗莱明把装有混浊的葡萄球菌悬珠体瓶中又加入一些霉菌培养液，并在45℃下进行培养观察，3小时之后悬珠体混浊液开始变清了。
弗莱明在他那灰色布面的道林纸笔记本上，用墨水写下了这样一句使他誉满全球的话：“这表明在霉菌培养液中包含着有对葡萄球菌有溶解作用的某种物质”，这“某种物质”后来被命名为盘尼西林。
葡萄球菌是一种可以致病的细菌，许多疾病就是它从中作祟的结果。如今发现了溶菌物质，怎么能不让弗莱明高兴呢？1928年的圣诞节很快就要到了，处于兴奋状态的弗莱明，盘算着1929年在盘尼西林研究中作出怎样的成绩。
从1929年1月至6月，弗莱明和他的年轻助手里德利、克莱道克一块儿，研究了命名为盘尼西林霉菌的活动情况。盘尼西林能够生存在许多种不同的生物体中，生命力极强，经过试验证明它对活细胞无毒害作用，一系列试验结果简直使弗莱明高兴极了。他认为盘尼西林就是他长期梦寐以求的“完美无缺的抗菌剂”。
1929年5月10日，弗莱明将他有关盘尼西林的研究整理成论文，正式提交出版，这一版的复写本就是收藏家千金以求的珍本。论文的发表并没有给弗莱明立即带来荣誉和地位。相反，盘尼西林的试验又传来了不幸的信息。一些试验结果使弗莱明把盘尼西林作为一种全身或局部性抗菌剂的希望破灭了。这些试验显示了它的弱点，盘尼西林花了4个多小时，才能把细菌杀死；在血清存在的情况下，盘尼西林几乎完全丧失杀菌能力；如果盘尼西林通过静脉注射到兔子身上，30分钟之后就会消失在血液中，并不能穿过感染的组织，因而不能将表层下面的细菌消灭。
面对这样的困境，弗莱明认为如果继续研究盘尼西林在临床上的使用，恐怕是一件得不偿失的事。因此他没有去作关键性的动物保护性试验，而这些试验极有可能揭示出盘尼西林所真正具有的杀菌功能。此后，弗莱明放慢了盘尼西林的研究速度。
1930年以后的10年中，弗莱明发表了27篇论文，他一直将盘尼西林用于出售的疫苗生产中，他并不鼓励别人去作盘尼西林的提纯工作，他自己对此也毫无兴趣。1936年，磺胺第一次在世上出现时，更使得盘尼西林黯然无光，人们几乎忘却了盘尼西林。
然而，第一篇盘尼西林的文章发表以后，关于盘尼西林论文又陆续发表了。他们像射箭一样，一旦箭离开弓，箭可就不属于他了，盘尼西林在它的发现者处的冷遇，完全被牛津试验者的热度所弥补了，从1933年开始，一位名叫欧内斯特·金的化学家专门研究酶，是他使盘尼西林焕发了光彩。他在收集文献时发现了弗莱明的盘尼西林论文，他对弗莱明关于溶菌酶的设想十分感兴趣，他随即又将论文送交弗洛里。盘尼西林开始显示它的效力了。不久之后，弗洛里证明盘尼西林既不是溶素，也不是一种酶。但他对盘尼西林的抗菌效力十分满意。
1940年5月25日，弗洛里进行了动物保护性试验，证实了弗莱明的盘尼西林菌株具有强大的杀菌作用。这进一步鼓舞了弗洛里，他几乎把牛津大学，变成一个进一步将盘尼西林用于临床试验的工厂。翌年，提纯盘尼西林的工厂果然开业。
不久，弗洛里将提纯后的盘尼西林用于人体病员身上，取得了明显的效果，但遗憾的是他们发表的成果报告并没有引起公众的多大兴趣和反响，甚至连弗莱明本人对此也不置可否。
1942年8月，弗莱明的一位朋友患了脑膜炎，虽经磺胺药物治疗，但仍无效果。眼看病人快死了，弗莱明最后决定采用盘尼西林。他向弗洛里求援，弗洛里为他提供了一些盘尼西林并告诉他如何使用。用药之后，濒临死亡边缘的病人，奇迹般地恢复了健康。这位社会知名人士使弗莱明大夫马上成了无数家报纸采访的中心人物，盘尼西林立刻成了新闻界的宠儿。
在英美政府的鼓励下，当时的医药公司进入了这个领域，很快就找到了大规模生产盘尼西林的方法。起初，盘尼西林只是留给战争伤员使1用，但是到1944年，英美公民在医疗中也能够使用了。
随即，盘尼西林治疗各种疾病的神奇功能，在欧洲引起了一场“盘尼西林旋风”。不久，盘尼西林遍及天下，成了各科医生案头必备的抗菌剂，荣誉像雪片一样朝弗莱明飞来。
盘尼西林的发现对寻找抵抗菌素是一个巨大的促进，这项研究导致发明出了许多种“神奇的药物”，但是盘尼西林却是用途最广的抗菌素。
盘尼西林不断保持领先地位的一个原因在于它对许多有害微生物都有效。该药能有效地治疗梅毒、淋病、猩红热、白喉以及某些类型的关节炎、支气管炎、脑膜炎、血液中毒、骨骼感染、肺炎、坏疽和许多种疾病。
盘尼西林的另一个优点是使用的安全范围大。50万单位盘尼西林的剂量对某些感染是有效的，但每日注射100万单位盘尼西林也没有副作用。虽然有少数人对盘尼西林过敏，但是对大多数人来说该药为既有效又安全的理想药物。
盘尼西林已经救活了很多人的生命，成为第二次世界大战中与原子弹、雷达并列的三大发明之一。盘尼西林的大量生产，拯救了千百万伤病员，盘尼西林的发现是发展抗菌素历史上的一个里程碑。直到今天，盘尼西林仍是流行最广、应用最多的抗菌素。盘尼西林能杀灭各种病菌，还可以治疗各种炎症。也正是盘尼西林的发现，引发了医学界寻找抗菌素新药的高潮，人类进入了合成新药的时代。
1945年，弗莱明同弗洛里、欧内斯特·金分享了诺贝尔医学和生理学奖金。在这以后的10年里，弗莱明继续攀登在充满着胜利和成功的山路上，他曾经获得15个城市的荣誉市民的称号，25个荣誉学位以及140多次重大奖赏、荣誉和奖励。
弗莱明既是一位技艺超群的细菌学家，同时还是一位敏锐的、有鉴别力的观察家，他受到人类的永恒的尊敬。1955年，弗莱明，这位伟大的盘尼西林之父辞别了他精心维护的可爱的世界。