进入20世纪以后，微生物学得到了飞速的发展，研究的重点逐渐转移到了生化水平及分子生物学的水平上。自毕希纳发现了酒化酶以后，微生物的发展就开始深入到了生化水平。1901年维尔第尔斯发现酵母菌不能合成对其自身生长所需的全部成分，需要外界加入称为“Bios”的生长因子，同时还发现在麦芽中存在这种可透析的、耐热的“Bios”（即VB1复合物）。1904年哈登和扬等又发现酵母菌榨取汁经透析后会失去发酵活性，从而证明了辅酶的存在，同时他们还发现磷酸盐能促进酵母菌榨取汁的酒精发酵，并从中分离出有机磷酸化合物。在20世纪20年代初期，剑桥大学的斯蒂芬森和夸斯特尔对细菌酶着重是脱氢酶进行了研究，他们利用通伯技术（在装有给氢体、细菌悬液和美蓝的排气管中测定美蓝脱色的时间）对多种细菌的脱氢酶进行了一次系统的研究，在当时关于细菌合成代谢的知识极少或根本没有，所以说思蒂芬森他们的研究工作具有极大的引导意义。但关于由分解代谢途径产生的能量怎样贮藏及转变为功能问题，仍然未能解决。
青霉素的发现者弗莱明和链球菌的发明者瓦克斯曼1930年，卡斯特罗姆第一次把细菌中的酶划分为组成酶和适应酶，适应酶在细胞中不能检测到或者是以很低的浓度存在，但当把他们的作用底物加入到培养基中时，就会在很短时间内，并且在细胞不增殖的情况下明显的增加这些酶的含量。
经过反复的实验，弗莱明将培养物的滤液中所含有抗性的细菌物质叫做盘尼西林。但这种盘尼西林没有推广应用，直至1940年牛津大学病理学教授霍华德·弗洛里将其提纯，使它可用于人体肌肉注射，盘尼西林才得以推广应用。盘尼西林的发现重新引起了人们对土壤微生物产生抗生素的兴趣。
1944年，瓦克斯曼分离出第二种实用的抗生素——链霉素，而且链霉素的发现可以说是对盘尼西林的一种补充，因为盘尼西林作用于革兰氏阳性菌，而链霉素则作用于革兰氏阴性的肠杆菌科细菌以及盘尼西林无效的分枝杆菌，这样两种抗生素彼此代替使用可以使抗药菌株成为敏感菌株。
随后在40年代中期以后，从放线菌、细菌和真菌中已先后记述了5500种以上的抗生素，其中4000多种为放线菌产生，其余为细菌和真菌所产生，但临床上应用的不过100多种，常用的只有几十种。至今寻找抗生素的工作仍在继续进行，新的化合物不断涌现，这种状况犹如细菌和微生物学家之间的赛跑。细菌不断地产生对那些常用抗生素有抗药性的突变菌株，而微生物学家则百折不挠地寻找细菌还没有来得及形成抗药性的新化合物。
进入20世纪40年代以后，人们对细菌变异产生了新的兴趣。由于医学中抗生素的使用使菌株很快出现了抗药性，导致在临床治疗上的困难。这是一类具有临床意义的细菌变异，全世界的细菌学家把他们的注意力转向阐明这种变异的机理。而这时的几个重大发现恰正是在这些条件下发生的。一个是1941年比德尔和塔特姆用粗糙脉孢霉这种微生物代替高等植物或昆虫作为研究材料，他们用χ射线诱变筛选获得了大量的营养缺陷型突变株，它们均不能在基本培养基上生长，需要添加相应的生长因素。在大量分析比较的基础上他们提出了“一个基因一个酶”假说，这一假设现在已经被证实了。比德尔和塔特姆的创造性发现为生化遗传学的发展奠定了基础，他们首先把遗传基因的功能与酶或蛋白质的联系了起来，微生物营养缺陷突变型的发现也为进一步深入研究基因结构、调控、重组以及生物的形态分化和发育等创造了条件。1943年，卢里亚和德尔布鲁克进行了著名的波动性试验，其结果雄辩地证明细菌对噬菌体产生的抵抗性是基因发生自发突变所致，与它们是否同噬菌体接触无关。他们的研究结果随后又被纽坎比在1949涂布试验和莱德伯格于1952年的影印培养法进一步证实。细菌的基因突变发生在它们与噬菌体或药物接触之前，影印培养法仅作为一种筛选手段，将自发产生的抗性突变从大量的突变中筛选出来。1944年埃弗里、马克聊德和马克卡提在深入研究细菌转化，发现遗传物质的化学本质就是DNA。这是一个革命性的发现，因为在这之前，一直认为遗传物质是蛋白质，而这个发现彻底否定了这一看法，将科学家的视线转移到了DNA这一真正的遗传物质上来。1946年，莱德伯尔格和塔特姆又发现了一种与转化作用不同的细菌基因重组方式——接合作用，以后又发现基因的连锁现象，至20世纪50年代初，又发现F因子这种细菌质粒。
微生物抗菌素发明者——弗莱明
1984年3月1日，伦敦著名的拍卖行劳埃德商行的拍卖大厅里，人头攒动，熙熙攘攘。人们等待着购买他们最称心的物品。拍卖开始了，首先拍卖的果然是亚历山大·弗莱明的最早论文复写本，人们早就从拍卖公告中得知了这一消息。随着报价抬升，敢于竞争的买家越来越少了，最后，不足20页的论文复写本，竟然以2010镑的惊人高价被买走了。
这是一篇什么样的论文呢？
它是关于盘尼西林即盘尼西林抗菌剂的著名论文，出自弗莱明之手，多少年来，它是收藏家梦寐以求的收藏珍品。弗莱明是世界科技史上一位传奇式的人物，他发现了溶菌酶和盘尼西林，挽救了数以亿计的人们的生命，并因此曾荣获1945年诺贝尔奖。收藏家们认为，这篇题为《关于盘尼西林培养液的抗菌作用》的论文，具有普渡众生的魔力。
自从近代科学技术诞生以来，人类发明了难以计数的各种药物，但自始至终药效不减、遍及天下的，只有盘尼西林。它具有高效的抗菌功能，无副作用和不使病菌产生抗药作用等优点。从它诞生之日起，人们就将它视为“神药”。
盘尼西林药物的发现者亚历山大·弗莱明，于1881年8月6日出生在苏格兰基马尔诺克附近的一个小村子里。他的父亲是个勤俭诚实的农夫，生了8个孩子，弗莱明是最小的一个。弗莱明7岁时父亲去世，家里失去了主要经济来源。13弗莱明遵照父亲遗命到伦敦去同他那当医生的兄弟住在一起，随后在一家船运事务所当小工。在二十岁那年，接受了姑母的一笔遗产，他放弃了工作，进入伦敦大学圣玛丽医学院学习。学习期间，聪慧的弗莱明差不多取得了所有的奖章和奖学金，1906年以优异的成绩毕业，成了一名医生。毕业后他接受老师赖特博士的邀请，留在圣玛丽医学院的研究室里，帮助老师进行研究工作。也正是从那时候起，他立志把医学研究作为他毕生的事业。但在其后的8年中，弗莱明并没有在实验室里做出显著的成就。
赖特相信疫苗对抵抗细菌入侵具有神奇作用，长期以宗教般的热情从事研究工作。他的接种站的主要经济来源是出卖疫苗。弗莱明进入赖特预防接种站不久，很快便成为研究小组中一名骨干的成员，他发明了一些新的研究方法，制作了一些仪器，赢得了赖特和同事们的赞许。与此同时，弗莱明还成了研究梅毒和用注射洒尔福散治疗梅毒的专家。
正当弗莱明壮志满怀准备在传染病治疗领域大显身手的时候，1914年，第一次世界大战爆发，弗莱明应征入伍，成为英国皇家军医团的一名上尉。由于飞机、坦克等战争武器的首次使用，弗莱明目睹了首次大规模的战场——凡尔登战役。战争是惨烈的，法军与德军双方伤亡达70万人，以致战役结束时撤离战场的士兵每一步都会踩到一个死伤者。战争中无数的伤员被抬进了医院，清创缝合的手术从早做到晚。但弗莱明看到，那些被医生治过的枪伤或弹伤的创面仍会在细菌的侵害下感染溃烂，让那些没有死在战场上的士兵死在病床上。弗莱明和赖特在战争期间一起去战地医院服务，从事伤口感染的治疗。弗莱明的研究工作没有因战争而中断，他把研究传染病的热情转移到研究防治伤口感染上，这使他很快就抓住了问题的要害。
战后弗莱明加紧进行细菌的研究工作。