重组DNA技术（recombinant DNA technique）又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。所谓基因工程就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。
重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究——限制性核酸内切酶（简称限制酶）和基因载体（简称载体）。限制酶的研究可以追溯到1952年美国分子遗传学家S．E．卢里亚在大肠杆菌中所发现的一种所谓限制现象——从菌株甲的细菌所释放的噬菌体能有效地感染同一菌株的细菌，但不能有效地感染菌株乙；少数被感染的菌株乙的细菌所释放的同一噬菌体能有效地感染菌株乙可是不能有效地感染菌株甲。经过长期的研究，美国学者W．阿尔伯在1974年终于对这一现象提出了解释，认为通过噬菌体感染而进入细菌细胞的DNA分子能被细菌识别而分解，细菌本身的DNA则由于已被自己所修饰（甲基化）而免于被分解。但有少数噬菌体在没有被分解以前已被修饰了，这些噬菌体经释放后便能有效地感染同一菌株的细菌。被甲（或乙）这一菌株所修饰的噬菌体只能有效地感染甲（或乙），而不能有效地感染乙（或甲），说明各个菌株对于外来DNA的限制作用常常是专一性的。通过进一步的研究发现这种限制现象是由于细菌细胞中具有专一性的限制性核酸内切酶的缘故。
重组DNA技术中所用的载体主要是质粒和温和噬菌体两类，而在实际应用中的载体几乎都是经过改造的质粒或温和噬菌体。英国微生物遗传学家W．海斯和美国微生物遗传学家J．莱德伯格等在1952年首先认识到大肠杆菌的F因子是染色体外的遗传因子。1953年法国学者P．弗雷德里克等发现大肠杆菌产生大肠杆菌素这一性状为一种染色体外的大肠杆菌素因子所控制。1957年日本学者发现了抗药性质粒。后两类质粒都是在遗传工程中广泛应用的质粒。
重组DNA技术中广泛应用的噬菌体是大肠杆菌的温和噬菌体λ，它是在1951年由美国学者E．莱德伯格等发现的。
到20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础。1972年美国的分子生物学家P．伯格等将动物病毒SV40的DNA与噬菌体P22的DNA连接在一起，构成了第一批重组体DNA分子。1973年美国的分子生物学家S．N．科恩等又将几种不同的外源DNA插入质粒pSC101的DNA中，并进一步将它们引入大肠杆菌中，从而开创了遗传工程的研究。
步骤和技术路线：重组DNA技术包括了一系列的分子生物学操作步骤，一般包括五步。①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定；⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。在具体工作中选择哪条技术路线，主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。
一、外源目的基因的获得
主要的方法如下。
（1）从复杂的生物细胞基因组中利用限制酶取得具有黏性末端或平整末端的DNA片段。
（2）用机械方法剪切取得具有平整末端的DNA片段，例如用超声波断裂双链DNA分子。
（3）经反向转录酶的作用从mRNA获得与mRNA顺序互补的DNA单链，然后再复制形成双链DNA（cDNA）。例如人的胰岛素和血红蛋白的结构基因都用该方法获得。这样获得的基因具有编码蛋白质的全部核苷酸顺序，但往往与原来位置在染色体上的基因在结构上有区别，它们不含有称为内含子的不编码蛋白质的间隔顺序。
（4）用化学方法合成DNA片段。从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码。依照这密码用化学方法可以人工合成基因。
二、基因运载体的分离提纯
基因运载体是具有自体复制能力的另一种DNA分子，其经过处理后能与外来基因（外源性DNA）相结合，并带有必要的标记基因。常用的基因运载体主要有两类：一类是质粒，另一类是病毒（包括噬菌体）。以前者为例，首先用溶菌酶分解细菌细胞壁，然后用物理化学的方法，把质粒与其他成分分开，从而得到纯粹的质粒。
三、重组DNA分子的形成
通过专一限制性内切核酸酶的处理或人为的方法，使带有目的基因的外源DNA片段和能够自我复制并具有选择标记的载体DNA分子，产生互补的黏性末端而相互配对结合，并通过连接酶在体外使两者连接起来，形成一个完整的新的重组DNA分子。
1．DNA连接酶
常用的DNA连接酶有两种，其来源、性质、功能见表5－1。
表5－1两种DNA连接酶的比较
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项目T4 DNA连接酶E．coli DNA连接酶
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来源T4吞噬菌体大肠杆菌
辅助因子ATP NAD（上标＋）
底物①双链DNA分子的互补黏端、平端①同源互补黏端
②RNA－DNA杂合体，RNA链的缺刻②双链DNA分子中的单链缺刻
③双链DNA分子中的单链缺刻
应用范围最广较窄
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2．DNA片段和载体相连接的方法
方法主要有以下四种。
（1）黏性末端连接每一种限制性核酸内切酶作用于DNA分子上的特定的识别顺序，许多酶作用的结果产生具有黏性末端的两个DNA片段。例如来自大肠杆菌（Escherichia coli）的限制酶EcoR I作用于识别顺序↓…GAATTC……CTTAAG…↑（↑指示切点），产生具有黏性末端…G…CTTAA和AATTC…G…的片段。把所要克隆的DNA和载体DNA用同一种限制酶处理后再经DNA连接酶处理，就可以把它们连接起来。
（2）平整末端连接某些限制性内切酶作用的结果产生不含黏性末端的平整末端。例如来自副流感嗜血杆菌的限制酶Hpal作用于识别顺序↓…GTTAAC……CAATTG…而产生末端为…GTT…GAA的DNA片段。用机械剪切方法取得的DNA片段的末端也是平整的。在某些连接酶（例如感染噬菌体T4后的大肠杆菌所产生的DNA连接酶）的作用下同样可以把两个这样的DNA片段连接起来。
（3）同聚末端连接在脱氧核苷酸转移酶（也称末端转移酶）的作用下可以在DNA的3′羧基端合成低聚多核苷酸。如果把所需要的DNA片段接上低聚腺嘌呤核苷酸，而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸，那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过DNA连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接。
（4）人工接头分子连接在两个平整末端DNA片段的一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段，这里面包含有某一限制酶的识别位点。经这一限制酶处理便可以得到具有黏性末端的两个DNA片段，进一步便可以用DNA连接酶把这样两个DNA分子连接起来。
四、重组DNA导入宿主细胞
重组DNA即是带有目的基因的运载体（杂种质粒或病毒）。用人工的方法（转化或转导法），将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（宿主细胞）中，使其能在细胞中“定居”下来。通过自体复制和增殖，形成重组DNA的无性繁殖系（即克隆），从而扩增产生大量特定目的基因，并使之得到表达，即能指导蛋白质的合成。
将连接有所需要的DNA的载体导入宿主细胞的常用方法有四种：转化、转染、转导和注射。
1．转化（transformation）
用质粒作载体所常用的方法。分为化学法和电击法。
（1）化学法转化是由Cohen等人于1972年首创。基本原理是：当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca（上标2＋）、Mg（上标2＋）等）低渗溶液中时，菌细胞膨胀成球形，处于感受态；同时，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热冲击，细胞吸收DNA复合物，在营养丰富的培养基中生长数小时后，球状细胞复原增殖，该方法的转化效率可达10（上标5）～10（上标6）个转化子／μgDNA，可广泛应用于常规的基因克隆。
（2）电击法转化（electroporation）也称电穿孔法，最初用于将DNA导入真核细胞，自1988年起就被Dower等人用于转化大肠杆菌。基本原理是利用高压脉冲，在宿主细胞表面形成暂时性的微孔，质粒DNA乘虚而入，在脉冲过后，微孔复原，在培养基中生长数小时后，细胞增殖，质粒复制。该方法的特点是操作简单，不需制备感受态细胞，适用于任何菌株。其转化效率极高（一般可达10（上标9）～10（上标10）个转化子／μgDNA），所以常用于文库的构建及其他要求极高的转化。
2．转染（transfection）