一、概述
刺激性是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反应，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。如注射剂注射后引起的局部疼痛、炎症及静脉炎；滴眼剂、阴道栓、皮肤外用药及口腔黏膜用药引起刺激性等。
刺激性实验是观察实验动物的血管、肌肉、皮肤、黏膜等部位在接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应。药物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如pH、渗透压等）均有可能引起刺激性的发生。
刺激性实验研究，用于评价药物制剂在其直接给药部位的短期危害。特别是为了评价局部或肠胃外给药途径而进行的研究。
二、实验方法
（一）皮肤刺激性实验
1．动物选择
多种哺乳动物可以选择，一般首选白色家兔，每组动物数4～8只，雌雄各半。也可选用其他种属的动物（如小型猪等），选择家兔和小型猪以外的动物应阐明合理性。
2．操作步骤
（1）实验准备采用同体左右侧自身对比法，设赋形剂对照，实验前24h对给药区（通常在背部）进行脱毛处理（可剪、剃或用适宜的脱毛剂）。去毛范围左、右各3cm×3cm。给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不宜进行实验。进行破损皮肤的刺激性研究时，在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。
（2）给药剂量与方法受试物药量：一般固体或半固体0．5g，液体0．5ml，直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用两层纱布（2．5cm×2．5cm）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋形剂做对照。贴敷时间至少4h。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。多次给药皮肤刺激性实验应连续在同一部位给药，每次给药时间相同，贴敷期限一般不超过4周。
3．观察指标
按表4－3给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。
表4－3皮肤刺激反应评分标准
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┃皮肤反应性分值┃皮肤反应性分值┃
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┃红斑：┃水肿：┃
┃无红斑0┃无水肿0┃
┃轻度红斑（勉强可见）1┃轻度水肿（勉强可见）1┃
┃中度红斑（明显可见）2┃中度水肿（明显隆起）2┃
┃重度红斑3┃重度水肿（皮肤隆起1mm，轮廓清楚）3┃
┃紫红色红斑到轻度焦痂形成4┃严重水肿（皮肤隆起1mm以上并有扩大）4┃
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┃最高总分值8┃
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根据药物临床不同使用情况，皮肤刺激性实验分为单次和多次给药皮肤刺激性实验。
单次给药皮肤刺激性实验，在去除药物后30～60min，24h、48h和72h肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价恢复情况和时间，但延长期一般不超过14日。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查。
多次给药皮肤刺激性实验，在每次去除药物后1h以及再次贴敷前观察及记录红斑、水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后30～60min，24h、48h和72h肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间，但延长期一般不超过14日。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查。
4．结果评价
单次给药皮肤刺激性实验，计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值，按表4－4进行刺激强度评价。
多次给药皮肤刺激性实验，首先计算每一观察时间点各组积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物积分均值，按表4－4进行刺激强度评价。
表4-4皮肤刺激强度评价标准
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分值评价分值评价
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0—0．49无刺激性3．0—5．99中度刺激性
0．5—2．99轻度刺激性6．0—8．0强刺激性
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5．经验介绍及注意事项
（1）动物体重家兔一般为2kg左右，豚鼠300g左右。婴儿皮肤用药应当考虑用更年轻的动物，家兔1．5kg，豚鼠150～200g。
（2）敏感性有实验证明，皮肤刺激反应的敏感顺序为兔>豚鼠>大鼠>人>猜，因此有时兔皮肤毒性的敏感性高于人，可产生假阳性。故若受试样品不是大面积长期使用，轻度刺激反应可不予重视。
（3）动物饲养选择单笼饲养，自由饮食、摄水，饲料应为适合所选动物的全价颗粒营养饲料，饮用水至步应符合人用自来水标准。动物房温度控制在20～26℃，相对湿度为40％～70％。换气次数应为每分钟1O～20次。如果用人工光线照明，应12h明暗交替。
（4）给药浓度_艘应与临床制剂浓度一致。
（5）实验过程特别是破损皮肤实验及处死动物应考虑以人道方式进行。
（二）眼刺激性实验
1．动物选择
首选家兔，每组动物数至少3只，体重2 5～3．0kg，雌雄不拘。应设置赋形剂或生理氯化钠溶液对照组，可采用同体左右侧自身对比法。实验前2Ah对每只动物的双眼进行检查（包括使用荧光素钠检查）。有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于实验。
2．操作步骤
般采用与临床制剂相同浓度，设一个剂量组。受试物若是液体则每只眼睛滴入O．05～O．1ml；如是固体或半固体则涂敷O．1g。应设置赋形剂对照或生理氯化钠溶液对照组，必要时采用巳上市制剂作对照。
实验时轻轻拉开眼睑，将受试物滴入或涂敷于眼结合膜囊内，然后轻合眼睑约10s，一般不需冲洗眼睛。给药期限应根据受试物拟用于临床的情况来决定，多次给药时每天给受试物的次数应与临床用药频率相同，连续给受试物2～4周，一般不超过4周。
3．观察指标
（1）观察期应根据受试物的特点和刺激性反应情况来选择适当的观察时间。通常单次给药眼刺激实验，在给药后1h、2h、4h、24h、48h和72h对眼部进行检查，也可根据受试物的特点适当调整观察时间；多次给药眼刺激实验，每天给药前以及最后一次给药后1h、2h、4h、24h、48h和72h对眼部进行检查，也可根据受试物的特点适当调整观察时间。如果在72h未见任何刺激症状，实验则可结束。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限，但一般不超过21日。
（2）观察指标般采用裂隙灯（或手持裂隙灯）观察结膜、角膜和虹膜等反应，也可根据刺激性反应情况采用其他的合适器械（如放大镜、生物显微镜等）检蠢分泌物，并进一步用荧光素染色检查。每次检查，都应记录眼部反应的分值（表4—5）。除了观察所列出的结膜、角膜和虹膜损伤外，其他所观察到的损伤也应记录和报告。
表4—5眼刺激反应分值标准
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眼刺激反应分值
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角膜：
无混浊0
散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1
半透明区易分辨，虹膜模糊不清2
出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见3
角膜不透明，虹膜无法辨认4
虹膜：
正常0
皱褶明显加深、充血、肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应1
出血／肉眼可见坏死／对光无反应（或其中一种）2
结膜：
充血（指睑结膜和球结膜）
血管正常0
血管充血呈鲜红色1
血管充血呈鲜红色，血管不易分辨2
弥漫性充血呈紫红色3
水肿：
无水肿0
轻微水肿（含眼睑）1
明显水肿伴部分眼睑外翻2
水肿至眼睑近半闭合3
水肿至眼睑超过半闭合4
分泌物：
无分泌物0
少量分泌物1
分泌物使眼睑和睫毛潮湿或黏着2
分泌物使整个眼区潮湿或黏着3
最大总积分16
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4．结果评价
按表4—5的要求，将每个观察时间点每个动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值。按表4—6判断其刺激程度。
表4—6眼刺激性评价标准
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分值评价分值评价
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0—3无刺激性9—12中度刺激性
4—8轻度刺激性13—16强刺激性
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5．经验介绍及注意事项
（1）给药浓度一般为原液。洗发剂眼刺激实验可参考实际使用情况，原液给药，后用水或生理氯化钠溶液冲洗。
（2）敏感性有时家兔所出现的刺激反应大于人的反应。应具体情况具体分析。
（三）血管刺激性实验
1．动物选择
首选家兔，动物数每组小少于3只，体重2．5～3．Okg，雌雄不拘。应设生理氯化钠溶液或溶剂对照，可采用同体左右侧自身对比法。
2．操作步骤
一般采用与临床制剂相同的浓度，设一个临床剂量或高于临床剂量组，给药容积及速率应根据临床用药方案、动物情况等调整。给药期限应根据受试物拟用于临床应用的情况来决定，多次给药一般不超过7日。
给药部位可选用耳缘静脉、耳中心动脉（其他动物可选用前、后肢静脉及股动脉等）。首次注射在血管远端进针，以后每次注射比前一次注射部位略向前移。观察结束后，处死家兔，剪下兔耳，从血管距最远端1cm处开始，每隔1cm切下0．5cm宽的标本，按顺序编为A、B、C、D、E、F等数段，用10％甲醛固定、脱水、包埋、切片，进行病理组织学检查。
3．观察指标
应根据受试物的特点和刺激性反应情况来选择适当的观察时间。通常单次给药刺激性实验，在给药后48～96h对动物和注射部位进行肉跟观察；多次给药刺激性实验，每天给药前以及最后一次给药后48—96h对动物和注射部位进行肉眼观察（表4—7）。观察期结束时应对部分动物进行给药部位组织病理学检查并分级，其余动物应根据受试物的特点和刺激性反应情况，继续观察14～2l日再进行组织病理学检查，以了解刺激性反应的可逆程度（表4—8）。
表4—7大体检查分级
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分值血管壁刺激反应分值血管壁刺激反应
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0无明显反应3中度至重度充血，肿胀，耳下垂
1轻度充血4同3，且有轻度至中度坏死
2轻度至中度充血，肿胀5同3，且有重度广泛坏死
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表4—8病理组织学分级
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分值血管壁刺激反应
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0基本无变化
1血管变化限于耳缘静脉，可能有坏死或栓塞，一般限于给耳C段至D段，A段无变化，
也可见中度水肿，纤维蛋白沉积或出血，但仅限于血管周围
2变化类似“1”、水肿，纤维蛋白沉积，出血或炎性浸润，扩展至半只耳壳，A段血管无变化
3变化类似“2”，但耳缘静脉以外的静脉也有栓塞和（或）坏死，水肿，纤维蛋白沉积，
出血或炎性浸润扩展至半只耳壳以上，但栓塞和坏死限于半只耳壳
4变化类似“3”，病变扩展至2／3耳壳
5变化类似“4”，但全耳发生弥漫性变化
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4．结果评价
根据肉眼观察和组织病理学检查的结果进行综合判断。
5．经验介绍及注意事项
（1）给药浓度大输液一般采用原液。其他制剂可设置高低剂量组，低剂量组浓度应不低于临床使用浓度。
（2）由于药物在血管的流动性大，往往检测不出药物本身的刺激性，所以该实验方法不是评价药物对血管刺激的最适当方法。有人建议用小剂量、较高的浓度局部封闭给药，或者采用家兔眼刺激或肌肉给药方法进一步评价。
（四）肌肉刺激性反应
1．动物选择
首选家兔，也可选用大鼠。动物敬每组不少于2只，家兔体重2．5～3．0kg，大鼠体重250—300昏雌雄不拘。应设生理氯化钠溶液或溶剂对照。
2．操作步骤及观察指标一般采用与临床制剂相同浓度，设一个临床剂量或高于临床剂量组，给药容积及速率应根据临床用药方案、动物情况等调整。给药期眼应根据受试物拟用于临床应用的情况来决定，多次给药一般不超过7天。
实验时分别在家兔左右两侧股四头肌内以无菌操作法各注入一定量的受试物，观察给药后不同时间注射局部肌肉反应情况，如充血、红肿、变性、坏死等。末次注射后48h处死动物，解剖取出股四头肌，缴向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应，按表4—9计算相应的反应级，并进行局部组织病理学检查。
表4—9肌肉刺激反应分级标准
3．结果评价
根据表4—9计算出4块股四头肌反应级的总和。若各股四头肌反应级的最高与最低之差大于2时，应另取2只动物重新实验。在最初或重试的2只家兔4块股四头肌反应级之和小于10时，则认为供试品的局部刺激实验符合规定。
4．注意事项
（1）在长期毒性或药效学实验中也可以评价肌肉刺激。
（2）一般采用一次给药，给药体积为1ml。
（3）为方便结果观察，以受试物溶媒／赋形剂作为阴性对照，如受试物有轻微刺激时，可以采用已上市制剂作为对照。