书城医学药理学实验方法
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第6章 药理学实验常用仪器

一、生化分析仪

生化分析仪是临床检验及科研中经常使用的重要分析仪器之,它通过对血液或者其他体液的分析来测定各种生化指标:如转氨酶、血红蛋白、白蛋白、总蛋白、胆固醇、肌肝、葡萄糖、无机磷、淀粉酶、钙等。结合其他临床资料进行综合分析,可以帮助诊断疾病,对器官功能做出评价,鉴别并发因子等。所谓全自动生化分析仪,就是把分析过程中的取样、加试剂、混匀、保温反应,检测、结果计算和显示以及清洗等步骤进行自动化的仪器,它可完全模仿并代替手工操作,具有灵敏、准确、快速的特点,不仅提高了工作效率,而且减少了主观误差,提高了检验质量。全自动生化分析仪涉及光学、精密机械、自动控制、电子电路、热工学、生物化学、分析化学等学科,且要求高精度、高可靠性,是一个十分复杂的系统,国内外常见品牌有贝克曼一库尔特、奥林巴斯、日立、深圳迈瑞等。多数全自动生化分析仪都需要纯水装置,应配置配套的纯水机。应设定本实验室的质控靶值。各个实验室应确定本实验室的正常值范围。对于不同种属的动物应分别积累。应优先考虑与仪器相配套的试剂。严格按照操作规程进行清洗。样品针、试剂针和搅拌棒等要每天清洗,反应槽、透光窗和过滤网每月应清洗一次。当吸光度超出一定范围或不稳定时应及时更换光源灯。反应杯和密封垫等也应按照使用情况定期更换。加样和加试剂等部分的转轴应定期清理,先擦净旧油,再用高纯度的润滑油薄薄涂匀。对仪器机械系统定期校正、参数的校准和软件的维护等,都是保证检测质量的重要方面。

二、血液/血细胞分析仪

血液/血细胞分析仪是医院与科研单位常用仪器之一,随着科学技术的发展,其性能已相当完善。主要操作实现了自动化、微量化,同时提高了检验结果的精确度和准确度。按对血细胞的分类能力,血液分析仪大致可分为三分类和五分类血液分析仪,五分类比三分类的血液分析仪增加了一些新的参数,特别是血小板计数更可靠,前者取代后者是必然趋势。三分类的血液分析仪器主要由机械系统和电学系统组成,五分类的血液分析仪器则由机械、电学和光学系统以不同形式的组合而构成。安装环境应尽可能无尘、无机械振动、无大噪音源和电源干扰,不要靠近电刷型发动机、闪烁荧光灯和经常开关的电接触性设备,避免阳光直射或置于热源及风源附近。一般要求电源电压波动在±10%以内,需一个良好接地的电源插座以提供所需的电源,如可能,应连在专用地线上。血细胞分析仪细胞计数最适温度为18~22℃,低于15℃或高于30℃均对结果有影响。这类仪器所测出的细胞大小及数目实际上是电压脉冲的大小及数目。因此,所有影响脉冲大小及数目的因素都会对分析仪的检测产生影响,其中主要有仪器本身及试剂方面的环境因素,故应尽量减少环境对仪器的影响。由于静脉血受外界因素影响较小,成分比较稳定,检测结果准确度高重复性好,因此除婴儿外,建议取血者均应采用静脉血。上述抗凝血在室温下,WBC(白细胞计数)、RBC(红细胞计数)、PLT(血小板计数)可稳定24h,白细胞分类可稳定6~8h,血红蛋白可稳定数日,但2h后粒细胞形态即有变化。虽然4℃条件可延长血液贮存期,但血小板不宜在低温下贮存,否则会影响PLT和MPV(血小板平均体积)值,不能即时检测时,血液应在室温保存。阻抗法计数细胞的原理除基于细胞在测试系统中产生的脉冲大小外(如粒细胞最大,淋巴细胞最小),还与溶血剂的种类、稀释液的渗透压、离子强度、电导率、仪器出厂时仪器内固定的孔电流和脉冲增益等诸多因素有关。换言之,上述任一参数的变化,均可导致脉冲的变化,致使细胞计数和分类计数发生错误。因此血细胞分析仪对试剂的要求非常严格,要求有严格的渗透压标准、稳定的导电率、高标准的纯净度以及对仪器管道和阀路无腐蚀作用。欲得到准确的结果,原则上应使用原仪器的配套试剂。对于动物血样,应采用专用的稀释液才能得到满意的结果。人血中包含有蛋白及其他颗粒,在采样计数过程中它们可能黏附在计数孔和管道中,时间长了,堆积起来会影响测量结果。根据检测器上微孔堵塞的程度,通常将其分为完全堵孔和不完全堵孔两种。如发生完全堵孔,标本不能通过微孔计数,也不显结果,容易判断。不完全堵孔主要通过下述方法判断:计数时间延长,表示仪器检测器发生不完会堵孔;仪器示波器上出现异常波形,红色计数指示灯无规律闪动常是不完全堵孔的表现。堵孔问题一方面靠每次采样结束后的高压灼烧以及每天和每周的保养来避免,另一方面仪器也设置了一个监控堵孔的部分,一旦监控到计数时间超过设定的范围,仪器将报警,提醒用户注意解决堵孔问题。

三、流式细胞仪

流式细胞术(flow cytometry,fc)是20世纪70年代发展起来的一种利用流式细胞仪对在高速流动的液包裹下的细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观多参数相关检测分析与分选的新技术。它借鉴了荧光显微镜技术与血细胞计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术“及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。目前拥有市场较大份额的公司是美国的BD(Becton-Dickinson)公司、Beckman-Coulter公司和德国的Parter公司。除电源外,流式细胞仪主要由四部分组成:流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管和检测系统、计算机和分析系统,其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。流式细胞仪系统流程大致为:标本→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统→计算机系统→结果打印。流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用,其免疫荧光染色的标本制备非常重要,常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果。解决这些影响因素的方法如下:①确保标本上机检测前的浓度为1×10(上标6)/ml,细胞浓度过低直接影响检测结果。②使用蛋白封闭剂,封闭非特异结合位点,尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。③荧光抗体染色后充分洗涤,注意混匀和离心速度,减少重叠细胞和细胞碎片。④设置对照样品,采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。⑤判定结果时,应注意减去本底荧光,为使免疫荧光的定量分析更精确,应用计算机程序软件,用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值,可以得到更准确的免疫荧光定量结果。⑥注意染色后避光,保证细胞免疫荧光的稳定。

四、生物机能实验系统

生物机能实验系统为安全药理实验(主要观察受试药物对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统的影响)常用仪器,通过该系统可观察到各种生物机体内或离体器官中探测到的生物电信号以及张力、压力、温度等生物非电信号的波形,从而对生物机体在不同的生理或药理条件下所发生的技能变化加“记录与分析。生物机能实验系统首先将原始的生物机能信号,包括生物电信号和通过传感器引人的生物非电信号进行放大(有些生物电信号非常微弱,比如碱压神经放电,其信号为微伏级信号,如果不进行信号的前置放大,根本无法观察)、滤波(由于在生物信号中夹杂有众多声、光、电等干扰信号,这些干扰信号的幅度往往比生物电信号本身的强度还要大,如果不将这些干扰信号滤除掉,那么可能会因为过大的干扰信号致使有用的生物机能信号本身无法观察)等处理。然后将处理的信号通过模数转换进行数字化并将数字化后的生物机能信号传输到计算机内部,计算机则通过专用的生物机能实验系统软件接受从生物信号放大、采集硬件传人的数字信号,然后对这些收到的信号进行实时处理,一方面进行生物机能波形的显示,另一方面进行生物机能信号的实时存储,对于存储在计算机内部的实验数据,生物机能实验系统软件可以随时将其调出进行观察和分析,还可以将重要的实验波形和分析数据进行打印。

生物机能实验系统一般包括微型计算机,智能型生物信号采集、放大硬卡和生物信号显示与处理软件。由于生物机能实验系统是一个实时的数据采集与处理系统,因此在进行数据采样时,最好不要使用其他Windows应用软件,以免占用处理器的有效时间,使正处于数据采集的系统出现问题。在进行数据采样与处理时,应关闭实时监视程序,比如实时病毒监测程序。不要使用屏幕保护程序和高级电源管理程序,比如硬盘关闭程序等。生物机能实验系统与计算机机壳公用地线,因此,在开始使用生物机能系统进行生物机能实验时,必须将计算机的机壳接地。否则,除了影响电生理实验效果之外,还可能造成其他的问题。实验过程中,避免空调风向影响实验操作,干扰数据的采集。

五、动物行为活动记录分析系统

动物行为活动记录分析系统是观察实验动物(小鼠、大鼠等)在自然状态下的活动情况,可以满足神经药理、学习记忆药理、抗衰老药理和新药种经系统一般药理毒理研究的需要,用于评价药物对精神神经系统的影响。在特定的实验装置(笼或箱),通过直接观察计数或借助光电计数装置以及视频计数(如红外光由对侧照射过来,动物阻挡红外光束的次数可以用微型计算机或计算器记录下来)来测量一定时间内动物(大鼠或小鼠)的活动计数。应用计算机辅助系统可以同时记录局部运动、站立以及运动速度等,还可自动处理和分析动物的各种活动,并给出所需要的实验结果。本系统包括摄像系统和信号处理系统两部分。常用的标准行为学实验模块包括旷场实验模块、自主活动实验模块、多臂迷宫分析模块(包括T-迷宫、Y-迷宫、辐射迷宫等)、Morris水迷宫实验模块、高架十字迷宫、O迷宫以及具体行为规律统计分析等。应注意的事项:①实验时要及时排除易反光物质;②不同动物用不同的参数分析:③应设空白对照;④气味对动物的自主活动有影响,每次实验后应及时清洗。