孵育及结果判断：准备完毕后，将平皿放入35～37℃解箱内培养16～24h，取出后观察结果，若受试药物有抗菌作用，则沟或纸条旁会出现无菌生长地带，记录其长度，制定标准，以判断该受试药物抑菌作用的强弱。
【注意事项】实验用平皿应有平坦的底部和相等的直径，因为琼脂层的厚度能影响抗菌药物的扩散，琼脂的厚度减少，则抑苗圈扩大。
每种抗菌药物与培养基接触时间应是固定的。抑菌圈在一定程度上决定于抗菌药物与琼脂培养基的接触时间。因为抗菌药物需要一定的时间才能扩散入琼脂内。
接种菌量正确与否是影响结果的重要因素，取决于麦氏比浊标准的配置，正确使用和保存，抑菌圈测量工具的精密度应符合要求。
培养基的pH和成分会影响抑菌圈的大小，故应严格控制。
扩散法的优点是可在一个平皿上实验多种药物（或一种受试药物的多种浓度）对某一特定菌种的抗菌作用，且作用强度可以定量测定，效率较高，是目前常用的方法，但结果精确度差，故仅用于初筛。
（2）稀释法稀释法抗菌药物敏感实验根据稀释培养基的不同可分为肉汤稀释法和琼脂稀释法，是一种定量检查方法，结果准确、可靠，琼脂稀释法是美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的抗菌药物敏感实验的参考方法。
①肉汤稀释法：有常量稀释法和微量稀释法。前者每管含药肉汤含量为1ml（也可为2ml），后者常在商品化的微孔板上进行，每孔含0．1ml含药肉汤。
a．常量肉汤稀释法
【原理】其原理是将药物与肉汤培养基混合进行稀释，形成一系列的浓度梯度，然后接种一定量的待测细菌，经过适当的培养后，能抑制细菌生长的最低浓度，称为该抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC），即为药物抗菌作用敏感性的判定指标。
【方法】培养基的配制：CLSI推荐用阳离子校正的MH培养基，即在MH液体培养基中含有Ca2＋10～25mg／L，Mg2＋10～12．5mg／L，pH应为7．2～7．4（阳离子储藏液制备：称取3．68g CaCl2·H2O，溶于100ml去离子水中，即含Ca2＋10mg／ml。称取8．36g MgCl2·6H2O，溶于100ml】去离子水中，即含Mg2＋10mg／L）。将上述储藏液按浓度量加入MH培养基中。也可根据实际情况选择适合实验菌生长的液体培养基。
接种菌液的制备：有2种方法配制接种菌，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3～5个，接种于4～5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2～6h。增菌后的对数生长期菌液用生理氯化钠溶液或MH肉汤校正浓度至0．5麦氏标准，约含1×10的8次方～2×10的8次方CFU／ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18～24h的菌落调配成0．5麦氏标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1：100稀释后备用。注意应在15min内接种完配制好的接种苗，并取一份接种菌在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种菌纯度。
稀释抗菌药物的制备：准备一系列装有同样体积液体培养基的试管，于第一管中加入同体积的药液，以对倍稀释法逐管稀释药液，所以药液浓度在每管中是呈两倍递减的。具体方法：于13支试管中加入MH肉汤培养基各1．0ml，第一管加入供试液1．0ml，混合后吸取1．0ml加入第二管中，同法稀释至第12管，从第12管中取出1．0ml于一灭菌空试管作为空白对照，不加实验菌以便观察供试被是否被污染。设供试液的浓度为200U／ml，那么1～12管的浓度则为100、50、25、12．5、6．25、3．12、1．56、0．78、0．39、0．19、0．10和0．05U／ml。第13管为阳性生长对照管。如果同一样品一次测定对多株实验菌的抑菌效果，可用一系列大管按上法进行供试液的对倍稀释，然后分装于各支灭菌试管中，这样可保证每管实验菌的抑菌药液浓度的一致性。某些稀释剂或助溶剂可能对实验菌生长有抑制作用，需设相应对照管，即对照培养基中稀释剂或助溶剂的浓度应与第1支（最高抑菌浓度）实验管中的稀释剂或助溶剂的浓度相等。同时加入与各实验管同量菌液。正常实验时，空白对照管应无菌生长，阳性生长对照管及助溶剂对照管应有菌生长，如其中任何一种对照管不成立时，需要重新进行实验。
菌液接种及孵育：取适宜的稀释菌液0．1ml于各抑菌实验管中，一般接种量为每毫升药液含10的3次方～10的5次方个细菌，摇匀，使实验菌与药液能充分接触。将各实验管置于规定温度下培养16～24h，特殊实验菌可适当延长一定时间，然后观察结果。若肉汤浑浊表示细菌生长，若肉汤完全清亮，表示无细菌生长。
结果判断：在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种菌的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC使是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80％细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。
【注意事项】培养基先灭菌再定量分装于各灭菌试管，以避免因灭菌水分蒸发造成各实验管培养基量的不足，影响各管抑菌药液浓度的准确性。
细菌接种量，药液pH以及培养基成分与温度必须尽量做到恒定。肉汤在加入某些受试药物后，如出现混浊，影响结果判断，可采用葡萄糖粉红肉汤代替普通肉汤。
因细菌生长发酵葡萄糖产酸，能使酚红变成黄色，就更易读取结果。
对营养要求高的细菌，可在肉汤中加入10％无菌血清等。若出现单一跳管，则记录抑制细菌生长的最高药物浓度，若出现多次跳管，应进行重复实验。
b．微量肉汤稀释法
【原理】微量肉汤稀释法药敏实验原理同常量肉汤稀释法，是近年来临床微生物实验室应用较多的体外抗菌实验方法，优点是一块板可同时测定多种抗菌药物。
【方法】抗菌药物和培养基制备：同常量肉汤稀释法。
微量肉汤稀释实验板的制备和保存：无菌操作，抗菌药物在板外稀释后，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10ul，第12孔不加药作为生长对照。也可用多孔定量加液器，在孔中进行连续稀释，使微量板孔中含有梯度浓度药液，末孔为对照。冷冻干燥后密封，－20℃以下保存备用。
接种菌液的制备：用生长法或直接调制菌悬液制备浓度为0．5麦氏标准（相当于10的8次方CFU／ml），再将菌液稀释200倍，取100ul加入每孔中，此时每孔含菌量5×10的4次方CFU
被测菌株的接种：被测菌株悬液调整浓度后，应在20min内接种完毕。为证实种入菌悬液含量为5×10的4次方CFU／孔，在实验结束后，从每个实验菌空白对照孔，用定量加液器吸取1ul，接种于普通MH平板上，第二天计数菌落，应为5×10的2次方CFU。
孵育：已接种的微孔板加盖用胶纸密封并置湿盒中，以防水分蒸发，35～37℃孵育16～20h，如为厌氧苗置于厌氧缸内孵育24～48h。微孔板放置时，不可超过5个叠起。
结果判断：首先观察普通MH琼脂平板上集落生长情况，是否有杂菌污染、计数菌落数量。然后再读取无抗菌药物的对照孔，从低浓度到高浓度逐一比较，以肉眼观察无菌生长孔为最低抑菌浓度（MIC）。为使结果快速清晰，可在每孔中加入5g／L氯化三苯四氮唑（TTC）5ul，35℃孵育1～3h后有细菌生长孔呈红色，有助于结果判断。
新药研究的体外抗菌株应分别计算出MIC范围、MIC50与MIC90，可填写在表中，如表3－6。
表3—6 xxx药对xxx株细菌的MIC测定
细菌株数药物MIC范围MIC50 MIC90
A
B
【注意事项】当阳性对照孔（即不含抗菌药物）内细菌明显生长实验才有意义。
当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复实验。
②琼脂稀释法
【原理】琼脂稀释法敏感实验是将不同剂量的抗菌药物，分别加于融化并冷至50～55℃的定量琼脂培养基中，混匀，倾注成无菌平板，即为含有药物浓度递减的培养基。接种菌液r该培养基上，经培养后观察细菌的生长情况，抑制细菌生长的最低药物浓度为该药物的最低抑菌浓度。其优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌。
【方法】含药琼脂平板的制备：培养基为MH琼脂，按厂家规定进行配置时加水量要减少1／10，以备补充稀释后的抗菌药物，pH 7．2～7．4，121℃15min灭菌，水浴中冷却至45～50℃；直径90mm平皿加一个浓度的抗菌药物2．5ml，再加入MH琼脂25ml（刻度烧杯量），充分混匀琼脂厚度3～4mm。配制好的含药琼脂平板应放在塑料袋内密封，4～8℃中保存，用于质控实验平板，只能保存5天，常规实验时，略可延长使用时间。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1％添加剂；其他链球菌使用含5％（V／V）绵羊血的MH琼脂（当实验磺胺药时，使用溶解的马血）。
菌液制备与接种：为获得准确的MIC结果，接种被检菌数量，必须控制在规定范围内，即每个斑点中应含10的4次方CFU。如前述方法制备浓度相当于0．5麦氏标准的菌悬液，再1：10稀释成10的7次方CFU／ml。30min内，将上述被检菌株悬液接种至含抗菌药物的一系列平板上。接种方法有多种，最好用接种器，一次可接种大约36～52个菌株，每根针约可接种2ul菌液。接种前平板必须相当干燥，操作时从低浓度的琼脂平板种起。为了核对每个被检菌株的生长或污染状况，最后还需点种一个不含抗菌药物的对照平板，即将每株被检菌悬液，用定量加液器吸取1ul菌液，接种在1／2无抗菌药物的MH琼脂平皿上，充分划线，第二日观察是否有污染，菌落计数，菌落数大约为1×10的4次方CFU。
孵育：接种好的平板，放置室温让接种液充分被吸干后，置于（35～37）℃孵箱内16～20h，读取结果。
结果判断：将平板置于暗色、无反光物体表面上判断实验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80％以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
【注意事项】薄雾状生长成单个菌落可忽略不计；若在数个平板上呈拖尾或跳板生长等现象，应该重做。
（3）体外最小杀菌浓度实验常用的定量评价抗菌药物杀菌效力的实验主要有最低（或最小）杀菌浓度（MBC）测定和杀菌曲线法（KCs）。
由于影响杀菌实验的技术因素较多，某些实验的方法尚需进一步的标准化，某些菌种或菌株对杀菌药物可表现为“耐受”现象，
①最低杀菌浓度（MBC）测定法最低杀菌浓度（MBC）为某抗菌药物杀灭接种检测菌量的99．9％或以上的最低药物浓度。常规测定方法的前部分同前述MIC测定的试管稀释法，测出MIC后将未见细菌生长各管培养物漩涡混匀后分别吸取0．1ml倾倒于2个平皿上，37℃再培养18h，用活菌计数法检查平皿上菌落，平均数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度（MBC）。在新药抗菌药效学评价中应对临床分离的致病菌株求其MBC，MBC50及MBC90。
②时间－菌曲线法（KCs）：时间－杀菌曲线法（KCs）主要用于评价一种抗菌药物对检测杀菌的速率。以及两种（或两种以上）抗菌药物对检测菌的联合杀菌活性。选择适当的浓度测定杀菌曲线。将所试菌液（接菌量约为10的5次方CFU／ml）与抗菌药物混合后，定时取样于平皿培养孵育后计算其活菌数，并绘制出时间－杀菌曲线。
【方法】检测菌准备和培养基同MIC测定的肉汤稀释法。
取无菌试管5支，分别标记“0，4，8，24h实验管”和“生长对照管”。每管加MH肉汤10ml另外再准备4．5ml无菌生理氧化钠溶液试管数支。
在各试管中分别加入定量的测试药物，其含量一般为该药在体内能达到的平均血药浓度2～4个，也可采用1／2MIC，MIC，2MIC，4MIC浓度。
在各管中分别加入0．1ml浓度为0．5麦氏浊度标准的待测菌液，各管菌液的最终浓度约10的6次方CFU／ml。
加菌后立即将“0小时”管和“生长对照”管漩涡混匀15s，按下式稀释1000倍：取0．5ml加到第一管4．5ml生理氯化钠溶液中，漩涡混匀后又取0．5ml加到第二管4．5ml生理氯化钠溶液中，同法再取0．5ml加到第三管生理氯化钠溶液中。
分别从“0小时”和“生长对照”的第三稀释管中取0．1ml菌液接种到血平板上，这样稀释后的最终接种菌量约10的2次方CFU／ml。实验管和生长对照管各接种两份，用L型玻璃棒均匀涂布接种，35℃孵育过夜后做菌落计数并取其平均数。
培养4h后将“4h”管漩涡混匀15s，同上法稀释1：100和1：10后分别取0．1ml稀释后菌液接种到4个血平皿上。“生长对照”管漩涡混匀后稀释1：10的4次方～1：10的5次方后各取0．1ml接种，35℃孵育过夜后做菌落计数并取其平均数。
培养8h后“8h”管的处理方法同“4h”管。“生长对照”管应稀释1：10的6次方后接种，同上培养进行菌落计数。
培养24h后将“24h”管漩涡混匀后分别取0．1ml菌液接种到2个血平皿上，“生长对照”管应稀释1：10的7次方～1：10的8次方后接种。35℃孵育过夜后做菌落计数并取其平均数。
将各时间点测得的平均菌落计数，在半对数坐标纸或坐标纸上绘制杀菌曲线图。
在新药的Kcs研究中还应设已知药物对照实验（最好是同类化合物或相同抗菌作用的药物）
3．培养条件对药物抗菌活性的影响
体外实验中，药物抗菌活性可能受到培养基的pH、细菌接种量、药物与血清蛋白结合等的影响，且各种药物在体外条件影响差别较大，因此在实验中，需要充分考虑这些影响药物抗菌活性的因素。