制作菌种用的场地如接种室、培养室等使用前要进行严格、彻底的消毒，以减少杂菌污染和虫害发生。消毒通常在使用前三天进行：首先搞好室内外环境卫生，清除干净残留的培养料、垃圾等污染源；其次用甲醛、硫磺或气雾消毒剂等药品密闭熏蒸消毒，消毒后开窗通风两天即可使用。消毒方法如下。
（1）每100立方米空间用硫磺0.5千克、敌敌畏0.1千克、甲醛0.2千克，与木屑混合加热，密闭熏蒸24小时。
（2）每立方米空间用甲醛10毫升、高锰酸钾4～5克，放于盘内，密闭熏蒸24小时。接种箱密闭1～2小时即可。
（3）环保型熏蒸剂消毒。环保型熏蒸消毒剂（必洁仕牌复方熏蒸消毒剂）具有使用简单方便、杀菌效果好、价格低、无毒、无害、无残留、无致畸致癌物的特点。使用时将A剂药片投入B剂溶液中，两者催化反应，产生消毒气体，密闭空间即可达到消毒目的。此法广泛用于食用菌生产各个环节的消毒。
（4）气雾剂烟熏法。气雾空气消毒剂可对各种接种箱、接种室、发菌室、栽培室、更衣室等进行全方位的消毒，具有高效、快速、无毒性残留等优良特性。使用时用火柴或烟头点燃后释放出大量烟雾，然后密闭门窗0.5～1小时，待烟雾散尽后（一般需3～4小时）即可入内接种操作。
（5）紫外线照射。每次接种前，将各种器具、培养基等移入接种箱（室）内，打开紫外线灯照射30分钟。
由于长期使用某一种消毒药品，会使杂菌产生抗药性，因此，制种场地消毒不可长期使用同一种药品，应隔断时间更换另一种药品。