定慧寺始建于东汉献帝兴平元年(194)，初名普济庵，距今已1800 余年，是全国著名寺庙之一。宋代普济寺曾易名善济寺，清康熙改称定慧寺至今，取“由戒生定，因定发慧”之意。
唐代玄奘法师的弟子宝寂和鉴真大师的弟子神邕在此创建了大雄宝殿和佛堂；宋代佛印、枯木、无门等高僧先后扩建了寺庙，谈禅说法，研讨佛事，使其声名大振；明清以来经历代住持的不断修葺形成了“一寺十三房”的大丛林和“禅净双修”的宗风。
定慧寺以研究佛学著称于世。
鉴真大师真身从日本归国省亲，日本森本长老专程前往定慧寺礼佛，并书赠“山川异域，风月同天”一幅，住持茗山法师酬以“寄诸佛子，共结来缘”。此偈说的是唐朝日本长屋王太子来中国学佛，学成回国后制成袈裟千件、并在每件衣服上均绣上了这四句话，托请遣唐使带到长安赠送老师和同学们。千年之后，中日两位高僧续起了前缘，表达了两位高僧共祝中日友好的良好愿望。
现今世界各地的高僧大德有不少曾求学于此。按照茗山法师的遗愿，2002年有关方面沿寺庙的中轴线兴建了新的山门。几经兴废的定慧寺现在仍基本保持着明代的建筑风格。