巴斯德不想和他们无谓地争论，他在给父亲的信上说：“我并不浪费时间去答复他们的责难，他们爱说什么尽可请便，真理站在我这一边。”但却由此想到了进一步的实验，看看是否所有地方的空气中都含有同样多的胚芽。
他准备好了一些烧瓶，装上酵母汁或肉汤一类的营养液，放在火上煮沸一段时间，然后再将瓶口烧熔封好。他把这些瓶子拿到巴黎天文台，在地下室里（这里很洁净且空气无明显流动）打开了10瓶，又马上重新封好，然后又在院子里打开11瓶，也重新封好。正如他料想的那样，洁净的地方空气中的胚芽少，在地下室打开的10瓶里只有1瓶变质，而在院子里打开的11瓶全都变质产生了微生物。
1860年暑假来临了，巴斯德准备了大批装有煮沸过的营养液并封好的瓶子，开始旅行。他先回到家乡阿尔布瓦，在父亲的鞣皮作坊附近打开了20个瓶子，父亲的老朋友们围上来看热闹，对他古怪的行为大惑不解：“他在干什么？闹着玩呢！”他又来到偏僻清静的郊外打开了20瓶。然后去萨兰，在海拔850米的普佩山上打开了20个瓶子。巴斯德有些想入非非，他真想坐上气球往高处飞，以便证明海拔越高胚芽越少。当然，他还是选择了去登山，这样更容易些。
巴斯德来到达夏蒙尼，雇了个向导去登蒙唐韦山。早晨，他们赶着一条驮瓶子的毛驴出发了。巴斯德生怕震碎了他的宝贝瓶子，一直用手扶着装瓶子的箱子一步步向上攀爬。可到了山顶，意外的事情发生了，带去的酒精喷灯在阳光照射的冰块的反光中，刺眼得无法对准要封的瓶口。无奈，这次尝试宣告失败。
他们回到客栈，让附近的锅炉匠改进了酒精灯。第二天，他们又把瓶子带进了一个大冰川，这次巴斯德小心翼翼地开始工作，他把用来钳碎瓶子的钳子先在火上烧一下，防止污染瓶内的营养液，然后把瓶子高高举过头顶。用钳子折断瓶口，马上又封好。他这样处理好20个瓶子，带了回来。一段时间后，只有一瓶变了质，于是他断言：“游浮于空气中的灰尘是浸液中生命物质的独一无二的根源，必不可少的条件。”
巴斯德无懈可击的实验本该令人信服了，可自然发生论者就是不甘心，他们按照巴斯德的做法也准备了一些营养汁，但不是肉汤之类而是干草浸液，他们赶往比巴斯德去过的山峰还高的冰山，也打开又封好了瓶子。几天之后，这些人开始手舞足蹈了，他们乐不可支，因为他们在每个瓶子里都看到了许多小生物。他们声称：无论哪里的空气，都同样有利于生物的发生。舆论也似乎开始倾向于自然发生论者了。《新闻报》一位记者写道：“巴斯德先生，你引用的实验怕是搬起石头砸自己的脚……你想带领我们进入的世界真是太想入非非了……”
巴斯德怒不可遏，他认为对手们是群说谎者；对手们也毫不示弱，说他们的瓶子里要是有一瓶没长出微生物来，则愿意公开承认错误。双方剑拔弩张，要在科学院进行一场公开的实验。而就在最后关头到来之际，巴斯德的对手们退却了。
这实在是巴斯德的幸事，但对真理来说却是可悲的，因为双方的实验的确都是对的。许多年后，人们才知道了干草里藏有的微生物的顽强孢子，可以经得起几小时的煮沸，而不失去活性。
这场争论由于对手们临阵脱逃而平息。巴斯德便又开始对发酵进行探索。这时，毕奥、巴拉尔等人热切地盼望巴斯德能当选为科学研究院院士，他们为此而奔走，与别人辩论，去据理力争，然而毕奥终于没有等到巴斯德成为院士这一天，就溘然长逝了。
直到1862年，巴斯德才又被矿物学部提名为院士候选人，可这又触发了一场论战。有人提到巴斯德发现酒石酸盐的结晶是半面时说“半面在右边”。而一个德国人后来研究时说“半面在左边”。巴斯德对此并没在意，这不过是拿结晶的方向不同罢了。可谁知有人却旁敲侧击，蜚短流长，以此作为攻击巴斯德的武器。巴斯德不能容忍了，他找来木匠做了一个晶体的模型，拿到科学委员会上对反对者们大声说：“如果你们懂得这个问题，那么你们加以反对，居心何在，问心无愧吗？如果你们不懂，那么为什么要来干预、胡闹？”
会后他和助手迪克洛在回去的路上仍然很激动，迪克洛不禁问道：“以您当时的心情，为什么没有在发言结束时，拿起那个模型向反对者头上扔去？”巴斯德被逗得哈哈大笑起来。
1862年12月8日，巴斯德正式当选为法国科学院院士。第二天，巴斯德夫人手捧一束鲜花来到了毕奥的墓前，她要把这一消息告诉这位正直、慈爱的老人，让他在九泉之下，也为巴斯德而高兴。
1863年，拿破仑三世召见了巴斯德，巴斯德信心十足地对他说：“我的雄心是要认识腐败和传染疾病的原因。”
巴斯德要把一切生物必有母体的论点坚持到底。
1864年4月7日，巴斯德在索邦宽敞的大教室里，做了一次精彩的演讲。人们看戏般地涌来，有教授、有学生，还有诸如大仲马、马蒂尔德公爵夫人等名流。巴斯德开始以他那深沉坚定的语调，敏捷清晰的思路和无可辩驳的论据征服了在场的所有人。他把向公众传播科学，一直看成是自己的责任和义务。
生物自然发生的争论，从学术界走入了民间。有人不仅要问：“如果一切生命都来自胚芽，只有生命才能产生生命，那么第一个胚芽从何而来呢？”对此，巴斯德只能低头。他当时绝对无法知道这个100多年后的今天，仍没有准确结论的问题，他只好说：“研究起源问题不在科学范围之内，科学只承认能够证明的事实和现象。”
巴斯德就是这样，他在争论时会怒发冲冠、拍案而起，但冲突结束后，他又很快忘掉了这些。许多年后，有人同他谈起他一生中遇到的赞誉和诋毁的往事时，他说：“一个科学工作者应该只想到下一个世纪对他的评价，而不是斤斤计较这一天的赞誉和诋毁。”
他要尽自己的能力为科学、为公益事业做些事，他研究“长病”的葡萄酒：酸的、苦的或粘的，无论哪种都与其中的特定微生物有着直接关系。原因知道了，可怎样医治呢？他终于发现了，只要把葡萄酒加热到50℃～60℃后再密封，就不会变质了，这就是著名的巴氏灭菌法（一种加热杀死微生物的方法）。
巴斯德要把自己的发现告诉所有的酿酒师们。他收拾起行装，奔向阿尔布瓦，在一处简陋的房子里安装起仪器，对那些半信半疑地前来观看的酿酒师们说：“拿几瓶有毛病的酒来，你们不必告诉我它们的毛病是什么，我也不用尝味道，就能把它们的病症告诉你们。”酿酒师们窃窃私语，以为他是个一本正经的疯子。他们狡黠地相互看一看，挤挤眼，想捉弄他一下，于是回家拿了变质的酒及好酒。当巴斯德把一滴好酒放在了显微镜下观察时，时间一分一秒地过去了，酿酒师们开始暗自发笑，巴斯德紧锁眉头，他看不到使酒生病的微生物，于是他说：“这酒没有毛病，让尝酒师傅来尝尝。”尝酒师傅承认巴斯德是对的。一瓶瓶检查下去，“是苦的。”尝一尝果然是苦的。“是粘的。”尝一尝果然是粘的。酿酒师傅们开始暗暗称奇了，完全信服了巴斯德。巴斯德把保持酒不变质的方法传授给大家，使他们受益。
人们从四面八方找上门来，这里请巴斯德看看他们的酒为什么变酸，那里请巴斯德查查他们的醋为什么不酸。整个法国，从国王到酿造师都知道了巴斯德，他的事业蒸蒸日上。但对巴斯德来说，这只是开了个头。