（1861—1897年）
这个时期是以1861年巴斯德建立了胚种学说为标志开始的。本时期的代表人物主要是法国著名微生物学家巴斯德（1822—1895年）和德国医生、细菌学家科赫（1843—1910年），他们被分别称为微生物学和细菌学的奠基人。
巴斯德在帮助解决当地酿酒厂在酿酒生产中酒质变酸的问题时，指出了发酵是由于微生物的作用，并假设出每一种发酵都是由特定的微生物生长和代谢所引起的，这些研究促使他发明了一种不被其他任何微生物污染的微生物培养方法。早期他使用繁琐的液体稀释法来获得纯培养，后来他利用科赫发明的在固体培养基上分离的方法。为了完成这些工作，巴斯德创立了著名的灭菌方法——巴氏消毒法，并建立完成了稀释和次代培养的无菌技术。无遮火焰、烤箱和消毒锅都是巴斯德实验室最先使用的。他在研究蚕病（蚕微粒子病，1865年）、鸡霍乱（1879年）、炭疽病（1881年）和狂犬病（1885年）的工作中，证实了传染病由病原微生物所引起，并发现久置的鸡霍乱和炭疽病病原菌能诱发人体免疫力，从而使人类对传染病本质的认识提高到了一个新的水平。
在上述理论的指导下，巴斯德提出了一系列行之有效对付和利用微生物的方法：应用加热灭菌（即巴氏消毒法）解决了酒的变质（“酒病”）问题；应用消毒灭菌法来防止“腐败病”；应用检出并淘汰病蛾的方法来防止蚕病；发明用接种减毒菌苗的办法来预防鸡霍乱和牛、羊的炭疽病；他晚年还在狂犬病疫苗的研究上作出了贡献，应用狂犬疫苗来防治人类的狂犬病。他一生主要著作有《乳酸发酵》《酒精发酵》《蚕病学》等。此外巴斯德还通过著名的曲颈瓶试验证明了生物只能来源于生物，提出了生命起源的“胚种学说”，从而推翻了当时盛行的“自然发生学说”，为生物学的发展做出了突出的贡献。
另一位伟大的科学家科赫在培养细菌学方面的巨大贡献是发明了用固体培养基的“细菌纯培养法”和把混合培养物纯化的技术，并发明了固体培养基划线分离纯种法。这种技术给培养细菌学带来革命性变化，使19世纪最后20年中细菌学领域开出绚丽的花朵。
科赫于1881年发明了流动蒸汽灭菌法。他还采用染色法观察细菌的形态，并运用这些方法分离出多种传染病的病原菌。他在牛的脾脏中找到了引起炭疽病的细菌，并且把这种细菌移种到老鼠体内，使老鼠感染了炭疽病，最后又从老鼠体内得到了和牛身上相同的细菌。这是人类第一次用科学的方法证明了某种特定的微生物是某种特定疾病的病原。他在实验室中，在与牛体温相同的条件下用血清在动物体外成功地培养了细菌。
从1887年起，科赫开始着手探索肺结核病因的试验。肺结核在当时是人类健康的头号杀手，许多人死于结核病。他首先研究了因结核病死亡人的肺，慢性纤维空洞型肺结核病（冠状切面）但并没有发现细菌，可是当他把病肺磨碎，擦在老鼠和兔子身上后，它们都得了结核病。在反复实验中，科赫终于意识到结核菌是透明的，用显微镜是看不见的。因此，他开始尝试用各种色素去染因结核病而死亡的人的肺，最后终于在显微镜下发现了染上蓝色素的结核菌。用蓝色素染出的结核菌是细棒状的。接着他又用血清培养基对结核杆菌进行培养，16天后，终于他获得了人工培养的结核杆菌。他把这种培养菌接种在动物身上，动物也感染了结核菌病，至此，完全证实了结核杆菌是结核病的病因。他还用血清固体培养基成功地分离出结核分支杆菌，并且接种到豚鼠体内引起肺结核病。1883年科赫还在印度发现了霍乱弧菌，在1897年以后他又研究了鼠疫和昏睡病，发现了这两种病的传播媒介：虱子虱子和采采蝇采采蝇。
1884年，科赫根据自己分离致病菌的经验，提出了著名的“科赫法则”：1.在每一相同病例中都出现这种微生物；2.要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来；3.用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生；4.从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来，作为判断某种微生物是否为某种疾病的病原的准则。
科赫在病原体的确证方面作出了奠基性的工作，他创立的一系列微生物学的研究方法也一直沿用至今，为微生物学成为生命科学中一门重要的独立分支学科奠定了坚实的基础。科赫首创的显微摄影技术留下的照片在今天也算得上是高水平的。1905年，科赫以举世瞩目的开拓性成绩获得了诺贝尔生理学或医学奖。在科赫一系列研究成果的带动下，19世纪70年代到20世纪20年代成为发现病原菌的黄金时代。例如1883年和1884年有两位科学家各自独立地发现了白喉杆菌；1884年发现了伤寒杆菌；1894年意大利医生A.Yersin和日本的北里柴三郎各自分离出鼠疫杆菌；1897年痢疾杆菌也被发现了。在此期间人们先后发现了不下百种病原微生物，包括细菌、原生动物和放线菌等，不仅是动物病原菌，还有植物病原菌。