为了除去分枝杆菌以外的其他微生物，将组织样品置于加了酸或碱，如5%草酸或2%氢氧化钠匀浆缸内制成匀浆。不过，根据具体情况，也可采用其他浓度的化学药品去污，混合物于室温振荡10分钟，然后中和。悬浮液以3000r/m～5000r/m离心15分钟，弃上清液，沉淀物上层用于培养和显微镜检查。在确诊以前，组织样品-20℃保存。
初步分离是将沉淀物接种于一套含鸡蛋的分离用固体培养基，如Lowenstesin-Jensen，Coletsos和Stonebrink氏培养基，分别加丙酮酸钠或甘油或两者都加（每种1～2支斜面），或接种到琼脂培养基上，如Middlebrook 7H10或7H11培养基。
培养物在37℃含或不含CO2环境下至少孵育8周，培养基应放入密封管中，以防干燥。斜面于第1、第3、第5和第7周或更长时间观察其生长情况，将可见的生长物制备涂片，按齐—尼氏技术染色。一般看来，分离牛分枝杆菌的最好培养基是含有丙酮酸钠，不含甘油的Stonebrink氏培养基。牛分枝杆菌一般孵育3～5周后方可生长。
如果培养基发生污染，或样品检查为阴性，而眼观及组织病理学检查结果为阳性，那么，应用所推荐样品重复培养。冻结组织处理后至少接种豚鼠2只。去污染的沉淀物重溶于少量磷酸缓冲液，于后腿股部肌注0.5ml，4～5周后，用80国际单位（IU）禽结核菌素和80IU牛结核菌素试验。注射后24小时，测量硬结直径。如皮肤试验为阳性，便作解剖检查，收集异常淋巴结和其他组织作分离培养。如果为阴性，4～6周后重新做试验。
将疑为分枝杆菌的生长物用鸡蛋培养基和Middlebrook 7H10或吐温白蛋白肉汤作继代培养，孵育到可见生长物出现。有些实验室，接种之前先加无菌牛胆汁，可以促进菌块分散。
三、意外事故的处理
如果发生意外，必须立即通知实验室主管人员，并在有关人员的指导监督下对出事现场进行处理，绝对禁止未经报告而私自对出事现场给予非规范的处理。
实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生，应立即停止实验工作进行紧急处理，更换被污染的实验服，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒或酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗。
如果发生菌液溢出，含菌种的培养管破碎等，造成中、小面积污染，可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小时以上（其间适量加溶液防止干燥），再经紫外灯近距离（1米内）照射2小时以上；被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小时以上，实验完成后再进行高压消毒处理。
分离物的鉴定
分离物的鉴定可通过测定其培养特性和生化特性进行。在丙酮酸盐固体培养基上，牛结核分枝杆菌的菌落光滑、色灰白。37℃下生长缓慢，22℃或45℃不生长。该菌对噻吩一2一羧酸肼（TCH），异碱酸酰肼（INH）敏感。这可以在含鸡蛋培养基或Middlebrook 7H10/7H11琼脂培养基上生长得到证实。含鸡蛋培养基必须不含甘油，牛结核分枝杆菌生长良好，而且不含丙酮酸盐，因为丙酮酸盐能抑制INH，对TCH（INH的类似物）也有类似影响，所以会产生假阳性结果。牛结核分枝杆菌对对氨基水杨酸和链霉素也较敏感。有效的药物浓缩液对牛结核分枝杆菌的作用在琼脂或鸡蛋培养基上各不相同。此外，牛结核分枝杆菌不产生烟酸，不能使硝酸盐减少。在酰胺酶试验中，牛分枝杆菌为尿素酶阳性，烟酰酶和吡嗪酰胺酶阴性，微需氧，不产色素。鉴定还可用其他试验，包括DNA分析技术等。
一、牛型、禽型和人型结核分枝杆菌生化试验鉴定
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的鉴定，主要依据生化试验和动物试验。牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的生化试验特性见表。
1.烟酸试验
试验方法：以热蒸馏水浸泡固体培养基上的培养物15～30分钟，洗下。每个培养物分装入2支试管中，每管0.4ml，再加入3％联苯胺乙醇溶液0.2ml。然后向其中一管加入10％溴化氰溶液（此液剧毒，应在通风橱内操作）0.2ml。
结果判定：凡含10％溴化氢溶液的试管出现桃红色沉淀，另一管只产生无色沉淀者判为阳性；两支试管都为产生无色沉淀者判为阴性。
2.吐温一80（Tween一80）水解试验
试验方法：向100ml磷酸缓冲液（pH 7.0）中加入0.5ml Tween一80、2ml0.2％中性红溶液。经112kPa灭菌20分钟，分装于试管中，每管2ml。在4℃～10℃可保存2周。
取上述试管，加入10mg／ml的菌液0.5ml，37℃培养，3～5天观察结果。
结果判定：试管内由原来的琥珀色变为桃红色或红色者判为阳性。无颜色变化为阴性。
3、耐热接触酶试验
试验方法：用生理盐水配制出5mg／ml～10mg／ml的菌液，分装试管，每管0.5ml，以68℃水浴20分钟，冷却后加入0.5ml过氧化氢（H202。）和Tween一80混合液（10％Tween一80加等量30％H202。）。观察结果。
结果判断：肉眼观察，如有多量小气泡自管底升起，即为阳性，否则为阴性。
4、硝酸盐还原试验
试验方法：在100ml pH7.0的磷酸盐缓冲液中，加入硝酸钠85mg，经112kPa灭菌20分钟后分装，每管2ml。向上述溶液中加入10mg／ml的菌液，经37℃水浴2小时后，加入1滴2倍稀释的盐酸，2滴0.2％氨苯磺胺，2滴0.1％N-甲基盐酸二氨基乙烯。在4℃～10℃存放2周后判断结果。
结果判定：呈粉红色至紫红色者为阳性。无色或淡粉色为阴性。
5、尿素酶试验
试验方法：将被检材料接种尿素培养基，37℃培养。
结果判定：在尿素培养基上长出结核分枝杆菌菌苔（或菌落），并且使培养基变成红色，即为阳性；培养基不变色为阴性。
6、T2H（α-羧酸肼噻吩）抗性试验
试验方法：将被检材料接种T2H培养基和L-J（罗氏）培养基，37℃培养。
结果判定：在上述两种培养基上长出结核分枝杆菌菌苔（或菌落）即为阳性。若在L-J（罗氏）培养基上生长，而在T2H培养基上不生长，则为阴性。
二、动物试验
1.试验方法
试验动物在试验前，应进行结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测，鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测，兔用牛型和禽型结核分枝杆菌PPD检测。
将处理过的病料1～3ml，选用皮下、肌肉或腹腔内途径注射试验动物，每份病料至少接种2只同种试验动物。
接种后30天左右，对豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测；对鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测；对兔用牛型结核和禽型结核分枝杆菌PPD检测。如有阳性反应，可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴性反应，可于40天左右剖检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察至3个月再剖检观察。
2.结果判定
（1）牛型结核分枝杆菌感染：鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测阴性，无任何病变，细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。同时，从豚鼠和兔检测到结核分枝杆菌，或豚鼠和兔的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。
（2）禽型结核分枝杆菌感染：豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测阴性，无任何病变，细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。同时，从兔和鸡检测到结核分枝杆菌。或兔或鸡的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。
（3）人型结核分枝杆菌感染：仅从豚鼠检测到结核分枝杆菌，或仅豚鼠的牛结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。
将牛分枝杆菌与引起结核病的其他成员，如结核分枝杆菌（引起人类结核病的主要病原）、非洲分枝杆菌（为结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中间型）和田鼠分枝杆菌（为野鼠类杆菌，极少遇到的病原）区分开十分必要。按上述提及的试验方法可以把牛分枝杆菌与其他分枝杆菌区分开。
有时可以从牛结核病样病变的牛中分离到禽分枝杆菌。对这样的病例，须仔细鉴定禽分枝杆菌，要排除与牛分枝杆菌的混合感染。结核分枝杆菌可引起过敏牛对牛结核菌素反应，但不出现明显的结核病变。
三、PCR检测
1.PCR原理与反应条件
（1）原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物、DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作繁琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷，同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。