4.3反向PCR（Inverse PCR）：常规PCR是扩增两个已知序列之间的DNA片段，反向PCR则用于扩增位于已知序列的两侧的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段环化，再用限制性内切酶切开已知序列，这样线性化的原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列之间，再经常规PCR操作就可大量扩增未知序列。
4.4不对称PCR（Asymmetric PCR）：不对称PCR又称单链扩增PCR。一般PCR反应中两种引物的量是相等的，不对称PCR中，两种引物的量相差悬殊，一般为50：1～100：1，这样在生成一定数量的双链产物后，较少的引物就会被用完，大量生成一条单链的DNA，分离单链即可直接进行序列分析等研究。
4.5多重PCR（Multiplex PCR）：应用PCR技术可检测特定序列的存在或缺失。某些疾病的基因片段较大，且常有多处发生缺失或突变。用一对引物进行PCR检测时，扩增不到目的片段，此时就须使用多重PCR技术。在同一反应管中加人多对引物，扩增同一模板的多个片段，如果某一片段缺失，或扩增该片段的引物与被检核酸同源性太低，则在相应的电泳图谱上就无相应的正常片段出现，但可保证其他特异片段出现。目前报道的多重PCR反应，最多可同时扩增12条区带。当然，也可设计两对引物，分两次进行常规PCR。
4.6着色互补PCR（Colour complementation assay）：着色互补PCR又称荧光PCR（F1uroscent PCR）。其原理是用不同的荧光染料分别标记不同的寡核苷酸引物，通过多重PCR同时扩增多个DNA片段。反应结束后除去多余引物，扩增产物在紫外线照射下能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。通过颜色的有无及其组合可很快诊断基因的缺失、有变异或发现某些感染的病毒基因等。这一技术为PCR技术的临诊自动化诊断打下了基础。
4.7免疫PCR：免疫PCR即免疫多聚酶链反应（Immuno-PCR）。它是将高度灵敏的PCR技术与特异的免疫学方法相结合的一种新型的诊断技术，是目前最有希望的诊断方法。它的原理是通过DNA和抗体具有双重结合活性的连接分子使二者连接起来，这样就可以使作为指示系统DNA分子通过抗体而特异性地结合到抗原上，从而形成一种特异性”抗原-抗体-DNA复合物“，再通过对其中已知片段DNA的PCR扩增，即可证明抗原存在与否。这种方法的特点在于：①通过免疫捕获作用纯化检测对象；②用于检测的微生物无需事先明确其核酸序列；③该方法也适用于微生物以外的抗原检测，其前提条件是被检测对象具有良好的抗原性，并且备有其相对应的抗体；④无需根据不同对象设计不同的引物。被连接的已知片段DNA相当于指示剂，无论检测对象是什么，只需合成针对这段DNA的引物即可；⑤省去了普通PCR实验检测RNA病毒的反转达录过程，即增加了灵敏度又降低了实验成本。这项技术的发明者Sano，T.（1992）等的试验表明，免疫PCR的灵敏度比ELISA方法高10万倍，足以检测出单个抗原分子。
4.8套式PCR（Nested PCR）：普通PCR的产物DNA往往需要再扩增，以便对之进行进一步鉴定、分子克隆或用作其他用途。此时，由于DNA产物的末端效应，用原来的那对引物难以实现再扩增的目的。如果在原来的引物内侧重新设计一对引物，再进行新一轮PCR反应。这种采用多对成套引物，逐步扩增DNA内侧片段的PCR就称为套式PCR。目前很多分子生物学实验室为了各自的研究需要都在应用这一技术。
5.POR技术用途
5.1传染病的早期诊断和不完整病原检疫：在早期诊断和不完整病原检疫方面，应用常规技术难于得到确切结果，甚至漏检，而用PCR技术可使未形成病毒颗粒的DNA或RNA或样品中病原体破坏后残留核酸分子迅速扩增而测定，且只需提取微量DNA分子就可以得出结果。
5.2快速、准确、安全检测病原体：用PCR技术不需经过分离培养和富集病原体，一个PCR反应一般只需几十分钟至2h就可完成。从样品处理到产物检测，一天之内可得出结果。由于PCR对检测的核酸有扩增作用，理论上即使仅有一个分子的模板，也可进行特异性扩增，故特异性和灵敏度都很高，远远超过常规的检测技术，包括核酸杂交技术。PCR可检出fg水平的DNA，而杂交技术一般在Pg水平。PCR技术适用于检测慢性感染、隐性感染，对于难于培养的病毒的检测尤其适用。由于PCR操作的每一步都不需活的病原体，不会造成病原体逃逸，在传染病防疫意义上是安全的。
5.3制备探针和标记探针：PCR可为核酸杂交提供探针和标记探针。方法是：①用PCR直接扩增某特异的核酸片段，经分离提取后用同位素或非同位素标记制得探针。②在反应液中加入标记的dNTP，经PCR将标记物掺人到新合成的DNA链中，从而制得放射性和非放射性标记探针。
5.4在病原体分类和鉴别中的应用：用PCR技术可准确鉴别某些比较近似的病原体，如蓝舌病毒与禽流感病毒。PCR结合其他核酸分析技术，在精确区分病毒不同型、不同株、不同分离物的相关性性方面具有独特的优势，可从分子水平上区分不同的毒株并解释它们之间的差异，如新近建立的禽流感RT-PCR分子诊断技术。
此外，PCR技术还广泛应用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、肿瘤基因和抗癌基因以及抗病毒药物等研究中。
6.PCR技术应用概况：从诞生至今约10年的时间里，PCR技术已在生物研究领域得到广泛的应用。将PCR技术用于动物传染病的检疫诊断研究也El趋广泛。例如，新西兰农渔部质量管理机构所属动物健康实验室（AHLS）负责对各种外来疾病的疫情监测诊断，该室在1992年建立了几项PCR检测技术，包括从结核病病灶中快速检测牛分支杆菌；快速检测患病牛羊中副结核分支杆菌；检测恶性卡他热和新城疫等。
自1990年始，将PCR应用于动物传染病的诊断等研究的报道，可归纳如下：
6.1快速诊断各类病毒病：用PCR成功进行检测的动物传染病病毒有：蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛白血病病毒、马鼻肺炎病毒、恶性卡他热病毒、伪狂犬病病毒、狂犬病病毒。非洲猪瘟病毒、禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马传染性肺炎病毒、马立克氏病毒、牛冠状病毒、鱼传染性造血器官坏死病病毒、轮状病毒、鱼病病毒、水貂阿留申病病毒、山羊关节一脑炎病毒、梅迪一维斯纳病毒、猪细小病毒等。
6.2由其他病原体引起的传染性疾病的研究：目前已报道的有致病性大肠杆菌毒素基因、牛分支杆菌、炭疽杆菌芽孢、钩端螺旋体、牛巴斯虫和弓形虫等的PCR检测研究。在仪器微生物的检测中，PcR技术的应用也日益广泛。
Hornes等（1991）采用一种固相比色PCR技术成功检测了大肠杆菌热稳定肠毒素（STs）Ia（STIa）和Ib（STIb）基因。
二、连接酶链反应
在连接酶的下两段寡核苷酸能通过形成磷酸二酯键而连接形成较长的核酸片段。连接酶链反应（Ligase chain reaction，LCR）技术基于如下原理：在65℃，由于热稳定连接酶的作用，两段与模板正确杂交的寡核苷酸能连接形成新的较长的核酸片段。通过高温变性、适温退火和连接三步一循环的反应，新形成的靶核酸片段成为下一循环的模板而使反应延续，这样，扩增产物将像PCR一样呈指数递增。
LCR反应体系需采用4个寡聚核苷酸引物，其中两个与模板正链结合，另两个与负链相结合。引物长约15～20bp，故LCR扩增产物长约30～40bp。由于扩增产物较短，循环反应中的变性温度一般应比常规PCR要低。
热稳定连接酶分离自嗜热细菌，它能精确识别与模板正确杂交的寡核苷酸引物。由于碱基误配而杂交上模板非特异引物将不能起连接反应。与PCR相比较，LCR中非特异性扩增产物产生的几率很低，有资料表明，经过50~70个LCR循环，非特异性扩增产物未有明显增长，这样，可保证反应的高度敏感性和特异性。
LCR已应于检测人乳头瘤病毒、结核分支杆菌等病原体。目前，LCR的应用范围远不如PCR广泛，但LCR与PCR相结合，可有效解决分子生物学研究领域的一些问题，如启动子等小片断核酸的克隆等。
三、Q？复制酶技术
Q？复制酶是Q？噬菌体产生的一种依赖于RNA的RNA聚合酶。该酶于1963年由Haruna和Weissmann等人发现并命名。Q？复制酶能以某些单链RNA为模板，在体外大量复制单链RNA。该酶有严格的模板特异性，能在体外充当Q？复制酶模板的所有RNA分子均含大量的二级结构，且模板和产物RNA必须能在复制过程中形成稳定的分子内二级结构。
Lizardi等（1988）发现，在Q？复制酶的天然模板MDV-1RNA中插入一段疟原虫（plasmodium falciparum）的特异序列后，所形成的重组PNA片段仍可作为模板被Q？复制酶大量扩增。经37℃反应半小时，可在模板最低的反应体系（约含1000个分子）检测到129ng的重组RNA分子，相当于1亿倍扩增。Q？复制酶能扩增经过修饰的RNA片段，因此可应用于诊断和检测单链RNA或DNA序列。
据1992年发表的有关资料介绍，Gene Trak Systems的科研工作者已在用Q？复制酶开发传染病诊断的技术。其技术要点如下：先用异硫酸氰胍处理生物材料（如血、尿、脑脊髓液），使RNA释放出来。由于Q？复制酶通常不复制欲扩增的特异RNA序列，如HIV-1RNA；因此，待检材料须再做如下处理，先用一捕获探针（捕获探针与一种磁性小球偶联）通过杂交反应将HIV-1RNA”钓“出来，随后洗脱其他未结合的RNA分子；将其哺育，重复洗涤除去未与复合体结合的重组MDV-1RNA，最后加入Q？复制酶进行扩增反应。Q？复制酶将只扩增与捕获探针和HIV-1RNA所形成的复合体结合的重组MDV-1RNA。30min可扩增10‘～10’倍。
这一技术不直接扩增检测的特异的序列，而通过扩增与欲检测RNA分子相结合，这样虽增加了处理步骤，但可大大减少非特异性扩增产物。
复制酶技术尚待完善，但作为一项核酸扩增技术，亦具备可观的应用潜力。
第四节核酸电泳技术
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析技术等所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。
凝胶电泳操作简便、快速，可以分辨用其他方法（如密度梯度离心）所无法分离的核本片段，是分离、鉴定和纯化核酸的一种常用方法。
一、琼脂糖凝胶电泳
1.原理琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。将凝胶置电场中，在中性pH下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。
2.仪器及试剂仪器设备应包括水平凝胶电泳槽及其配套电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备紫外线检测仪和照相系统。
试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭溶液、凝胶和样缓冲液。
电泳缓冲液常用TBE（1000ml中含5.4gTris，2.75g硼酸，2m10.5mol/L EDTA，
pH8.0）
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，它可以嵌入核酸链的配对碱基之间，在电泳过程中随核酸片段迁移，将凝胶置紫外光下，插入核酸链中的EB在紫外线激发下产生红色荧光，可清楚显示各核酸片段的迁移。EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。由于EB是一种强的诱变剂并有中度毒性，使用时必须戴手套操作。
3.凝胶的制备和电泳操作方法如下：
3.1用透明胶将玻璃板或电泳装置所配备的胶板的边缘圈封，制成胶模，置水平工作台上；
3.2称取适量琼脂糖，置电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解；