3.杂交信号的检测当探针是放射性标记时，杂交信号的检测通过放射自显影进行。即利用放射线在X光片上的成影作用来检测杂交信号。操作时，在暗室内将滤膜与增感X光片依序放置暗盒中，再将暗盒置-70℃曝光适当时间，取出X光片，进行显影和定影处理；对于非放射性标记的探针，则需将非放射性标记物与检测系统偶联，再经检测系统的显色反应来检疫杂交信号。以地高辛的碱性磷酸酶检测反应为例，地高辛（Dig）是一种半抗原，杂交反应结束后，可加入碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体，使之在膜上的杂交位点形成酶抗体-Dig复合物，再加入酶底物如氮蓝四唑盐（NBT）和5-溴-3-吲哚酚磷酸甲苯胺盐（BCIP），在酶促作用下，底物开始显蓝色。其基本反应程序类似ELISA，杂交信号的强弱，通过底物显色程序的深浅、有无来确定。
第二节单克隆抗体技术
1975年Kohler和Milstein创立了生产单克隆抗体（简称单抗）的淋巴细胞杂交瘤技术。这项技术的诞生推动了整个生物医学领域的迅速发展。单抗作为抗原物质的分子识别工具除在生物医学基础研究、免疫和治疗方面得到广泛应用外，在疫病诊断和检疫中正在并将继续发展重要作用。
一、基本原理作为抗体生成理论的克隆选择学说是杂交瘤技术产生的理论依据，细胞融合技术和杂交细胞的选择方法是杂交瘤技术产生的技术基础。
1.克隆选择学说1957年Burnet提出的克隆选择学说认为：每一个B淋巴细胞有一个独特的受体（现在认为一个B淋巴细胞，产生与受体特异性相同的抗体分子）。一个淋巴细胞只产生一种抗体分子。因此，根据克隆选择学说，一个B淋巴细胞克隆只能产生一种抗体分子。这就是生产单克隆抗体的理论依据。
2.抗体多样性能的分子基础抗体分子生物学的研究为克隆选择学说提出了新的依据。抗体分子是对称的，由两条完全相同的糖基化重链（H）和两条完全相同的非糖基化轻链（L）组成。根据重链稳定区（CH）的不同，免疫球蛋白（Ig）可分为IgM、IgD、IgG、IgE和IgA五类，它们分别带有u、δ、γ、ε和a重链，又可进一步分为不同的亚类。重链和轻链均有一个可变区，分别用VH和VL，表示，决定抗体的特异性。每个抗体分子只有一种轻链。重链和轻链可变区具有抗原结合部，决定抗体的特异性。每个抗体分子都有两个相同的抗原结合部。对抗体基因的研究表明：重链和K链V区基因的数目分别为250个左右。任意一个VK基因片段可以与任意一个JK基因片段结合（J基因为连接基因）。JK有4片段，故可产生1000（250×4）个不同的VK区编码基因。同样，任意一个VH基因片段可以与任意一个D基因片段（D基因为多样性基因，在VH和JH基因之间，约有12个）及JH基因片段结合。这样可产生10000（250×10×4）个不同的重链V区编码基因。
重链与轻链的联合是随机的，因此可产生107（100×010000）个特异性抗体。此外，轻链和重链基因重排时的移码、重链D基因5’端和3‘端的修剪及随机延伸，不可产生多样性，因此特异性抗体的数目多得几乎是无限的。
3.细胞融合、筛选和杂交瘤技术的建立肿瘤细胞DNA生物合成有两条途径：一条由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，这是主要途径。这条途径可被叶酸拮抗物-氨基喋呤（A）所阻断。但如果培养基中含核苷酸”前体“次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，即便有A存在，细胞通过另一途径（称替代途径或应急途径）也可合成核苷酸。但后一途径需次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGRPT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）存在。
一些骨髓瘤细胞系在体培养过程中常常失去生产重链能力，甚至既不生产重链，也不生产轻链。有的还可丧失合成次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的能力。但在自然变异中，这种HGRPT（-）细胞在群体中只有百万分之几。如果在培养基中加入8-氮鸟嘌呤（8-AG）或瘤细胞系SP2/0、NS-1和X63/Ag-8（都是人工筛选的8-AG细胞），则在含氨基喋呤（A）的选择培养基中因DNA所有生物合成途径被阻断而死亡，但杂交细胞得到另一亲本（如脾细胞）的HGPRT，则可通过那条应急途径利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成DNA而得以生存下来。由此，可将杂交瘤细胞筛选出来。
Kohler和Milstein将HGPRT（-）骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的Balb/c动物脾细胞通过仙台病毒介导进行融合，在含次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的选择培养基（HAT）中进行培养。结果未融合的骨髓瘤细胞因无HGPRT和A的阻断而死亡，未融合的脾细胞因不具备连续培养特性也死亡，只有骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞形成的杂交瘤细胞因得到HGPRT酶并具备连续培养特性而生存下来。所获得的杂交瘤细胞经过克隆纯化后，具有能稳定分泌抗绵羊红细胞抗体的能力，注射动物能产生肿瘤，其腹水和血清含有高效价的同质抗体。由于该项技术的创立对生物医学做出了重大贡献，作者荣获1984年度诺贝尔生理和医学奖。
4.单克隆抗体与多克隆抗体的本质区别如上所述，单克隆抗体是源于一个B淋巴细胞的杂交瘤细胞分泌的针对抗原的同一表位的抗体；而多克隆抗体（简称多抗）是由免疫动物的无数不同的B淋巴细胞分泌的针对抗原不同表位的性质各异的混合抗体。单抗是同质的，多抗是异质的。把握单抗与多抗的这些重要区别，对于正确应用这两类抗体是十分重要的。
二、单克隆抗体技术的发展
自1975年建立该项技术以来，目前已取得新的重要进展，主要是：
1.融合技术除用聚乙二醇融合剂外，发展了融合、激光融合和定向融合技术。用Fox系骨髓瘤细胞与Rb8-12Balb/c动物脾细胞融合，存活的杂交瘤细胞均能分泌抗体。有的细胞生长因子可促进瘤细胞生长，在融合和克隆时把它加进培养液中，可不加饲养细胞，并能提高融合率、克隆成活率和阳性率。
2.发展了异源和非鼠源杂交瘤用动物骨髓瘤细胞与其他动物（如兔、牛、猪、绵羊等）脾细胞融合，获得异源杂交瘤。但融合率低，稳定性差。近年来报道了鸡和猪骨髓瘤细胞系研究成功，为研究鸡和猪源单抗准备了前提条件。
3.发展了双特异性抗体这是两种分泌不同单抗的杂交瘤细胞问融合产生的杂交瘤。其方法是先研制对HAT敏感的亲本杂交瘤细胞，然后与另一杂交瘤细胞融合，筛选。筛选出的杂交瘤分泌的单抗为双特异性。如单抗的一臂结合过氧化物酶，另一臂结合抗原，省去标记酶的过程。
4.发展了嵌合抗体、重构抗体和小分子抗体嵌合抗体是应用重组DNA技术对抗体基因进行置换，从而改变原来抗体性质。如用编码HRP或AP酶基因取代鼠单抗C区基因，表达产物既具有抗体活性，又具有酶活性。再如将毒素分子的编码基因与单抗V区基因拼接，表达产物即为免疫毒素，可特异地杀伤靶细胞。重构抗体是将动物单抗中与抗原决定簇互补的结构，即互补性决定区（CDR）基因取代人抗体可变区的CDR基因，表达具有动物单抗特异性的源抗体。通过DNA重组技术可以得到大小为完整IgGl/3的FabA片段、为完整IgGl/6的只由重链可变区构成的单链抗体以及为完整IgG分子1/12的只有VH区的单域抗体。
免疫球蛋白与抗原的结合主要决定于重链，轻链作用差些。一些不同特异性的抗体的VL区很相似。因此抗体基因库中VH基因与有限数目的VL基因排列组合可以构成任何需要的抗体。抗体基因工程可按人的需要构建新的抗体分子，将从根本上改变领先免疫获得抗体的状况。
三、单克隆抗体的应用
自1975年Kohler和Milstein报道，通过细胞融合建立能产生单克隆抗体的杂交瘤技术以来，这个最基础的具有开创性的理论在生物科学的基础研究以及医学、预防医学、农业科学等领域的广泛的实践，充分显示它对生命科学各领域产生的巨大而深远的影响。由于单抗有着免疫血清或抗体无法比拟的优点，迄今全世界已研制成数以千计的单抗，有的已投入市场，有的正在进行应用考核和深入观察。
1.在诊断学中的应用单抗应用最广泛的最诊断，主要用于病原诊断，病理诊断和生理诊断，随着微生物学、寄生虫学、免疫学的研究进展，人类对感染性和寄生虫性疾病有了新的认识，一个病原体存在许多性质不同的抗原，在同一抗原上，又可能存在许多性质不同的属、种、群、型特异性抗原，采用杂交瘤技术，可以获得识别不同抗原或抗原决定簇的单抗，从而可以对感染性疾病和寄生虫病进行快速准确的诊断，同时可以用于调查疾病流行情况，流行毒株或虫株分类鉴定，为病原的防疫治疗提供资料。目前应用单抗诊断试剂诊断的人、畜禽、植物等病毒、细菌或寄生虫病已有上百种，其中乙肝、狂犬病、乙型脑炎等人兽共患病30余种；鸡新城疫、马立克、猪瘟等畜禽病20余种；植物病毒病10余种；人、畜禽细菌病20余种；弓形虫、疟疾、旋毛虫等寄生虫病30余种。另外，单抗还成功应用于含量低微的激素、细菌毒素、神经递质的肿瘤细胞抗原的诊断。
2.单抗应用于临床治疗用单抗治疗肿瘤是医学界寄予厚望的一项研究，目前已研制了的肿瘤单抗有：胃肠道肿瘤、黑色毒瘤、肺癌等数十种，用单抗可能的治疗途径是采用高亲和并特异的单抗，偶联药物或毒素后（生物导弹）以定向杀伤肿瘤，目前该研究在实验动物中已获得成功，而单独使用单抗治疗人类恶性肿瘤获得成功的例子国外也有报道。使用单抗治疗畜禽传染病，尤其是病毒病如鸡传染性法氏囊，成效十分显著。近年来采用基因工程技术将抗体基因转入植物可以生产大量的单抗，另外具有不同用途的嵌合抗体、人源单抗、重构抗体、小分子抗体的出现，为应用单抗治疗各类疾病拓宽了道路。
3.单抗是生物学研究的有力工具目前，单抗已广泛应用于不同学科，其中一部分是为基础理论研究服务的，在病原方面可用于分类、分型和鉴定毒株，可用于探查抗原结构以及用于抗感染免疫机制和中和抗原的研究，结合分子生物学方法，可以确认病毒抗原蛋白的编码基因，基因突变和转译产物的加工、处理、组装过程，从而进一步研制基因重组疫苗。作为一种特异的生物探针，通过单抗的免疫组化定位，研究细胞的生理功能和疾病的病因、发病机制，对激素和受体可采用单抗的免疫分析，免疫细胞的定位，大大促进了激素和受体结构与功能，激素作用机理以及内分泌自身免疫性疾病病因的研究进展，另外单抗已应用于神经系统、血液系统、药理学和系统发育学、畜牧育种及性别控制等学科的研究工作中，从而极大的推动了整个生物学科的发展。
四、试剂的配制
细胞融合和杂交瘤细胞培养用试剂的配制：
1.RPMI-1640基础培养液1000ml
RPMI-1640粉10.4g
丙酮酸钠0.11g
用900ml三蒸水（或无离子水再经过双蒸），通CO2搅拌溶解。称取1.8gNaHC03，用少量三蒸水溶解，边搅拌边加入RPMI-1640液中。补足1000ml，通过0.22um滤膜正压过滤除菌（用C02钢瓶加压），分装，置30℃，菌检48h，4℃存放。有效期不超过3个月。
2.RPMI-1640完全培养液100ml
双抗（青、链霉素）0.1ml
3％L-谷氨酰胺2.5ml
犊牛血清15.0ml
1640基础培养液81.5ml
用时现配，4℃下存放不超过1周，用于细胞融合和克隆化培养的全培养液，可将小牛血清增至20％。
3.200ml（3％）L-谷氨酰胺溶液
L-谷氨酰胺5.846g
三蒸水200ml
加热至50℃使全溶，0.22um膜滤除菌，-20℃保存。
4.双抗溶液
青霉素（钠盐）100万IU
链霉素（硫酸盐）l 1g
溶于100ml灭菌三蒸水中，小量分装，-20℃冻存。
5.筛选小牛血清的方法取一份生长旺盛的杂交瘤细胞（或骨髓瘤细胞），按有限稀释法用不含血清的培养液稀释成每毫升5个和100个细胞，按每孔0.1m1分种于不含饲养细胞的96孔板中。其中，一部分板孔加待试小牛血清，一部分板孔加已知优良血清，每孔1滴（约0.025m1）。在37℃5％～7％C02温箱中培养7d左右，计数每孔细胞克隆数并估测群落大小，按克隆细胞的相对成活率和生长速度评价血清优劣。