1.2培养基：根据不同细菌选择相应培养基，一般常用肉汤、普通琼脂、血琼脂、无胨琼脂（用于磺胺类药物，其配制方法：牛肉膏或酵母浸膏5g，氯化钠5g，琼脂25g，水1000ml，将各成分加热熔解，调整PH7.2-7.4，过滤后分装，灭菌。临用时，将此培养基融化，倒入平板，凝固后，即可使用）。
1.3菌种：从病料中分离、培养、纯化的细菌或用标准菌株（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等，为冷冻干燥品，保存于5℃—8℃冰箱内，一般可保存约1—3年。使用时，无菌启开干燥菌种，接种于液体或斜面的菌种培养基上，于37℃培养24h，可见典型菌落。取菌种涂片、镜检，证明无杂菌存在，方可使用或放人冰箱5℃～8℃。试验用菌种每月传代一次，每季度平板分离一次）。
1.4试验方法
1.4.1化学消毒剂的杀菌作用：用经火焰灭菌的接种环，挑取细菌的纯培养物（量要适当多一点），以划线接种方式涂布到培养基表面。也可挑取待试验细菌在少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌的棉拭子蘸取菌液，或用灭菌的棉拭子蘸取细菌培养液，致密而均匀地涂布到培养基表面。以灭菌镊子夹取纸片（直径6mm）分别浸于消毒剂（如0.1％升汞、5％石炭酸、2％来苏儿、2％碘酊等）中，每种消毒剂浸2片。浸透后，再将纸片一一取出（使纸片与管壁接触，以除去多余的药液），分别放在已接种细菌的琼脂平板表面，各纸片间的距离要大致相等。置37。培养24h，观察结果。测量各消毒剂纸片周围的抑菌圈，并记录、分析试验结果。
1.4.2细菌对抗生素等药物的敏感试验：测定细菌对抗生素等药物的敏感度，可供临诊上正确选用药物时参考。
用经火焰灭菌的接种环，挑取细菌的纯培养物（量要适当多一点），以划线接种方式涂布到培养基表面。也可挑取待试验细菌，在少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌的棉拭子蘸取菌液，或用灭菌的棉拭子蘸取细菌培养液，致密而均匀地涂布到培养基表面。用灭菌尖头镊子，镊取已制备好的各种干燥抗菌药纸片，分别贴到培养基表面（为了贴紧可用镊子按一下纸片）。纸片在培养基上，一般在中央贴一种纸片，这样一只平板（90mm2）可贴6～7个抗菌药纸片。如果药敏纸片没有标记，在每贴一种纸片后，应在平板底的对应部位上，用蜡笔写上药品名或贴上标签。将贴纸片的平板底部向上，置37℃温箱内培养24h，取出观察结果。
1.5结果与判定标准：经培养后，有抑菌能力的抗菌药物，在纸片周围出现一个无菌生长的圆圈，称为抑菌圈。抑菌圈越大，说明该菌对药物的敏感性越大，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。
判定结果时，应按抑菌圈直径大小（mm）来判定敏感度高低的标准。一般抑菌圈直径20mm以上为极敏，15-20mm为高敏，10～15ram为中敏，lOmm以下为低敏。
2.试管法试管法比纸片法复杂，但试验结果准确可靠。因此，不仅能用于各种抗菌药物对细菌的敏感性测定，也可用于定量检查。
2.1试验方法：取试管10支排放在试管架上，于第一管中加上肉汤1.9ml，其余各管均各加lml。吸取配好的抗生素、磺胺药或中草药原液0.1ml，加入第一管，混合后吸取lml放入第二管，混合后再由第二管移lml到第三管，以此类推，直到第九管，吸取lml弃掉；第十管不加药液作对照。然后各管内加人幼龄试验菌0.05ml（培养18h的菌液，1：1000稀释），于37℃温箱内培养18-24h，观察结果。
2.2结果判定：培养18h后，凡无菌生长的药物的最高稀释管，即为该菌对药物的敏感度。若由于药物本身混浊，肉眼不易观察时，可将各稀释度的细菌再接种到新的培养基或涂片镜检，加以判定。
2.3挖洞法挖洞法是在接种的平板上挖洞，然后把药放在洞内，又称琼脂孔法。适用于中草药煎剂、浸剂或不易溶解的药物。
2.3.1原液的配制：有水煎剂和粉剂两种。粉剂可直接将中草药压碎研磨成细粉。水煎剂多配成lg/ml的溶液（取一定量的中草药，磨粉，加5～10倍量的水，或以水量淹没药物为止，煮沸lh，过滤，滤渣再加同量水，再煮沸lh，滤过。然后将两次的滤液混合，加热浓缩至每毫升相当于1g生药的浓度，经8lb灭菌15min）。
2.3.2培养基：一般用普通琼脂或血液琼脂平板。
2.3.3菌液：幼龄肉汤培养物（培养10～18h）。
2.3.4试验方法：用接种环取培养物少许或用灭菌棉棒蘸取培养物，均匀地涂布于琼脂平板上。以直径3mm的金属管在培养基上打孔，并于孔底加1滴熔化的灭菌琼脂，以密封孔底。然后加药于孔内，其剂量为0.025ml，粉剂则加满，于37℃温箱中培养24～48h。
2.3.5结果判定：可按纸片法测量抑菌圈的直径判定。
3.根据药敏试验选药原则完成药敏试验后，应根据结果选择敏感性较高，同时价廉、易得、安全的药物进行治疗，以减少耐药菌株，同时还应注意以下原则：
3.1在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。
3.2药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70－80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。如发现疗效不显著应及时换药。
3.3药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。
3.4窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。
3.5避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。
4.影响药敏试验结果的因素
4.1培养基：首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。其次，倾注平板时，厚度应合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
4.2细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
4.3药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4.4培养时间：一般细菌培养温度和时间为37℃12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。
5.药敏试验存在的问题
5.1方法学不统一，没有标准化。
5.2市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。所以还是建议按要求自制药敏纸片。
5.3因需要先进行细菌的分离培养，所以药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。但根据有关报道，也可进行简易的药敏试验，方法如下：无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1：5加生理盐水研磨制成悬液，静置5分钟，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5分钟后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小。
5.4对于部分营养需求较高的细菌或微生物，如链球菌和支原体，临床上较难培养，限制了药敏试验的应用。
5.5部分养殖场或基层兽医站缺乏做细菌分离培养和药敏试验的意识。绝大多数养殖者或技术人员是在没有明确微生物学诊断的情况下使用抗菌药物，养殖场规模越小，细菌培养和药敏试验做的越少，有的养殖场轮翻使用多种抗菌药物而不做细菌培养和药敏试验，致使疗效不佳，治疗时机延误和药品的浪费。一些病例用药前不做药敏试验，而是在大量使用多种抗菌药物疗效不明显时才想起做细菌培养和药敏试验，而此时细菌已对多种抗菌药产生耐药性。
第五节菌种的保存
在各种理化和生物学因素的影响下，微生物的生物学特性可能发生变异。为了进行微生物的基础研究和应用，需要保存一些标准菌株。因此，保存菌种是微生物实验室的一项基本工作。
保存细菌的要求是保持细菌存活，不污染杂菌，尽量少发生变异，保持菌株原有的生物学活性和培养特征。
保存细菌的方法很多，其基本原理是使细菌处于休眠状态，也就是说将其生命活动限制在最低限度。为达到这个目的，基本保存条件是干燥、低温和隔绝空气。细菌的各种保存方法都是根据这些基本条件设计的。兽医病原菌的保存常用继代培养、冷冻保存和冷冻干燥保存法。
一、继代培养保存法
继代培养保存法是保存病原菌的基本方法，既可以长期保存菌种，又能随时移植复苏，为微生物实验室最常采用的方法。其方法是选用对被保存细菌适宜的培养基，需氧或兼性厌氧菌常用如多塞氏鸡蛋培养基、营养琼脂斜面、血琼脂斜面、半固体培养基等；厌氧梭菌常用疱肉培养基。按常规方法接种细菌，37℃培养至生长菌苔或形成芽胞（厌氧芽胞杆菌），取出放在室温或4℃冰箱中保存，依菌种不同可每隔1～6个月继代移种一次。
1.注意事项
1.1继代培养应降低细菌的代谢活力，延长其存活时间，故培养基的营养成分不宜太丰富，而且培养温度应稍低于生长的最适温度。
1.2每株菌种应继代接种2管以上培养基，标明菌名及接种时间。
1.3在保存中应防止污染，棉塞应塞紧，避免在保存中掉出，棉塞底部应与斜面培养基上端距离2cm以上，必要时在细菌充分发育后，切去棉塞外部分，用石蜡封口（适于病原真菌）。
1.4为防止斜面、液体和半固体培养基菌种保存过程中干燥，可用灭菌的橡胶塞代替棉塞，或改用螺旋帽盖。
1.5细菌在长期保存后有时会发生变异，其生理活性、病原性、芽胞或荚膜形成能力等会降低，应予充分注意，最好能定期对保存菌进行检验鉴定。如条件允许，在一定期限时应继代接种一次易感动物，以保持或恢复其生物学性状。
1.6在人工培养基上存活时间短的病原菌，如巴氏杆菌、弯曲杆菌或易发生变异的病原菌如布氏杆菌、鸡嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等不宜用此法。
2.常用培养基
2.1多塞氏（Dorset）鸡蛋培养基：
全蛋80％
0.9％NaCl 20％
将鸡蛋表面洗净，并用酒精棉擦净，打入灭菌容器中。打碎后按上述比例加入0.9％NaCI溶液，混匀，用铺有灭菌纱布的漏斗过滤，分装试管，摆成斜面，用血清凝固器间歇灭菌。
此培养基适于多种兽医病原菌的保存，尤其对含有荚膜或毒力抗原的病原菌的保存。在4℃可保存6—12个月。
2.2营养琼脂斜面：见培养基的制造。
此培养基适于多种兽医病原菌的保存。如炭疽杆菌在室温下可保存5年以上（用橡胶塞）。一般细菌在4℃冰箱内可保存30d。
2.3半固体培养基：用穿刺接种法将细菌接种，置温箱培养18～24h后，在表面加上一层无菌液体石蜡（约lml），置4℃冰箱保存。一般细菌可保存3个月至半年。传代时应先将试管倾斜，使液体石蜡流至一边，再用接种针取菌接种于新培养基上。
2.4疱肉培养基：牛心脏浸出液（450g原料作成浸液）；蛋白胨20g；葡萄糖2g；氯化钠5g；蒸馏水加至1000ml。pH7.2，121℃高压蒸气灭菌15～30min。适用于厌氧梭菌的继代保存。
二、冷冻保存法
1.低温冰箱（-20℃）保存法
1.1操作方法：将保存菌接种液体培养基培养后，放在-20℃低温冰箱中。对多数病原菌都有良好的保存效果。
1.2注意事项：①为避免容器冻裂，应使用优良硬质玻璃试管或安瓿。②为避免冻裂，试管内菌液不能装满，一般以1～2ml为宜。③试管用橡皮塞或螺旋塞。如用棉塞时要用塑料薄膜包住棉塞。④培养液中加入10％一20％无菌甘油或血清。⑤冷冻菌株在取出解冻后，只能重新接种继代，不能用原管继续冷冻保存。