书城医学动物疫病实验室检验技术
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第22章 培养基制造技术(2)

1.3.1.2马丁牛肉浸液(beef infusion,Martin)

成分:牛肉500g;自来水1000ml。

制法:将去除脂肪、筋腱、肌膜的牛肉,用绞肉机绞碎,按上述比例放人适宜的容器内,搅拌均匀,置冰箱浸泡20~24h。取出,加热至40~60℃保持lh,然后加热煮沸30min,用水补足蒸发量,用白布过滤,滤液分装于玻璃瓶内,121℃30min高压灭菌,冷却后置冰箱保存备用。

用途:常用于配制马丁培养基,作细菌产毒、支原体检查等用。

1.3.1.3鸡肉浸液(chicken meat infusion)

成分:鸡肉100g(或500g);蒸馏水1000ml。

制法:取6~10月龄的健康母鸡肉,去除脂肪、肌膜和结缔组织后,用绞肉机绞碎,按上述比例加蒸馏水混合均匀,置冰箱浸泡20h,加热煮沸20—30min,补足蒸发量,冷却至50—55℃,用纱布棉花过滤,调整pH值至6.6~6.8,分装于瓶中,121℃30min高压灭菌,置冰箱保存备用。

用途:用于配制鸡肉汤培养基,培养副鸡嗜血杆菌,制备传染性鼻炎菌苗。

1.3.1.4牛肉肝浸液(beef liver infusion)

成分:牛肉250g,牛肝250g,蒸馏水1000ml。

制法:除去脂肪、筋腱并绞碎的牛肉及切成小块并绞碎的牛肝加水混合均匀,置冰箱浸泡20—24h,取出后加热煮沸20—60min,补足蒸发水量,用纱布棉花过滤,滤液分装于玻璃瓶内,116℃20min高压灭菌,置冰箱保存备用。

用途:用于配制厌氧肉肝汤培养基,培养、保存和鉴定厌氧菌。

1.3.2植物组织浸液的制备方法

1.3.2.1黄豆粉浸液(soybean powder infusion)。

成分:新鲜黄豆粉50g,氯化钠5g,纯盐酸lml,蒸馏水1000ml。

制法:将上述成分放入适宜的容器内,搅拌均匀,在40—45℃水浴中保持20—24h,取出,于121℃20min高压灭菌,用白布过滤,滤液用碱调pH值至7.8,分装于玻璃瓶内,再于121℃20min高压灭菌,冷却后,置冰箱保存备用。

用途:作一般培养基的基础液,亦可代替牛肉浸液。

1.3.2.2豌豆粉浸液(pea powder infusion)

成分:豌豆粉5g,氯化钠10g,蒸馏水1000ml。

制法:将上述成份放入适宜的容器内,搅拌均匀,加热煮沸1h,用煮沸的水补足蒸发量,冷却后,置冰箱过夜。次日取出,虹吸上清液,如不急用,应分装于玻璃瓶内,于121℃30min高压灭菌,冷却后,置冰箱保存备用。

用途:主要用于配制血琼脂、巧克力琼脂及亚硒酸盐琼脂等基础培养基。

1.3.3微生物细胞浸液的制备方法:微生物细胞浸液主要有酵母浸液(yeast infusion),以下以酵母浸液为例介绍其制备。

成分:新鲜啤酒酵母100g,蒸馏水400ml。

制法:将上述成份放人适宜的容器内,搅拌均匀,调节pH4.6,于沸水浴中加热10min,取出,过滤或离心,调节滤液pH值至7.0,过滤除菌,置冰箱保存备用。

用途:配制酵母浸液琼脂。

1.4盐类一般加入氯化钠或磷酸盐等以供给灰分元素营养。磷酸盐等则有缓冲作用。可维持培养基PH的稳定;氯化钠则常兼作调节渗透压作用。

1.5糖类、醇类糖类和醇类等包括多种,常用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇等供微生物作碳源,以观察其得利用和发酵反应情况。

2.特殊需要的物质

常用血液、血清、腹水、组织碎粒、鸡蛋等物加入专用培养基中,以提供特殊的碳、氮和生长辅助因素营养,满足某些微生物的特殊需要。

3.附加物质

3.1琼脂俗称”洋菜“,是从海藻中提制出的一种半乳糖硫酸酯。它在98度时能溶化于水,温度降至45度以下时则重新凝成凝胶状。琼脂在培养基中含量在1.5%以上时呈固体状态,在0.5%左右时呈半固体状态。一般微生物不能利用琼脂,它在培养基中只作固形剂用,以便分离与观察菌落特征。

3.2明胶系一种动物蛋白质,由动物的筋、腱等组织提制而得。它不溶于水,与水一起加热到25度时即可溶化,冷却后可凝成凝胶。明胶的硬度很低,不能像琼脂那样作固形剂。一部分能产生胶原酶的细菌可使用胶液化。可用作微生物的生化特性鉴定。

3.3指示剂在培养基中加入适当的指示剂,可以观察PH的变化或其它反应现象,从而显示培养过程中某些物质的利用和转化情况。常用的指示剂有酚红、碱性复红、溴麝香草酚蓝等。

3.4抑菌剂在培养基中加入适当的抑菌剂,可以抑制其它杂菌的生长而有利于目的菌的生长,方便增菌、鉴别和分离作用。结晶紫、抗菌素、孔雀绿、煌绿、胆盐等都是常用的抑菌剂。

二、培养基的制备方法

配制一般培养基的主要程序可分为:调配、溶化、校正pH、澄清过滤、分装、灭菌及检定等步骤。

1.调配按培养基处方准确称取各种成分,混悬于蒸馏水中。先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水,再加入蛋白胨等各种成分,以防蛋白胨粘附于瓶底,然后再用剩余的蒸馏水冲洗瓶壁。

2.溶化将各种成分混匀于水中,最好以流通蒸汽溶化半小时,如在电炉上熔化应随时搅拌,如有琼脂成份时更应注意防止外溢。溶化完毕,应注意补足失去的水分。

制备大量培养基时,除玻璃容器外,还可用搪瓷桶、铝锅等容器加热溶化,但不可用铜或铁锅,以免金属离子进入培养基中,影响细菌的生长。

3.校正pH pH的调节可用酸度计进行(使用方法,可参考有关说明书),一般培养基须校正pH至7.4~7.6。此外,亦有需要酸性或碱性培养基者,这与细菌对pH的适应范围有关。应当指出的是培养基在高压灭菌后其pH约降低0.1~0.2,故校正时应比实际需要的pH高0.1~0.2。

4.过滤澄清培养基配成后一般都有沉渣或混浊,需过滤澄清使其清晰透明方可使用,常用的过滤澄清方法有:①液体培养基:常用滤纸过滤,亦可在加热前加入用水稀释的鸡蛋白少许(每1000ml培养基用1个鸡蛋白),加热100℃后保持60~70℃,40~60min,使其不溶性物质附于凝固蛋白而沉淀过滤除去,以免高压灭菌后再出现沉淀。②固体培养基:如系琼脂培养基,于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中间夹脱脂棉过滤;亦可采用自然沉淀法,即将琼脂培养基盛入铝锅或广口搪瓷容器内,以高压蒸汽103.43Kpa 15min融化后,静置高压锅内过夜,次日将琼脂倾出,用刀将底部沉渣切去,再融化即可得清晰的琼脂培养基。

5.分装根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管等。分装的量不宜超过容器的2/3,以免灭菌时外溢。①基础培养基:应常贮存无菌的基础培养基,以便临时分装或配制鉴别培养基等。分装的量根据使用目的和要求决定,但必须定量分装,便于应用。一般常分装于三角烧瓶或盐水瓶内,灭菌后待用。②琼脂斜面:分装量为试管容量的1/5,灭菌后须趁热放置成斜面,斜面长度约为培养基长度的2/3。③半固体培养基:分装量约占试管长度的1/3,灭菌后趁热直立,待冷凝固。④高层琼脂:分装量约占试管长度的1/3。灭菌后直立凝固待用。⑤琼脂平板:将灭菌(或加热融化)后的培养基,冷至50℃左右,以无菌手续倾入灭菌平皿内,内径9cm的平皿倾注培养基约13~15ml,轻摇平皿底部,使培养基平辅于平皿底部,待凝固后即成。倾注培养基时,切勿将平皿盖全部启开,以免空气中的尘埃及细菌落入平皿。

新制成的平板培养基(简称平板),表面水分较多,不利于细菌的分离,通常应将平皿倾扣搁置于37℃培养箱内约30min,待平板表面干燥后使用。

6.灭菌①高压蒸汽灭菌法:高压蒸汽灭菌的温度与时间随培养基的种类及数量的不同有所差别,一般培养基少量分装时高压灭菌103.43kPa 15min即可,培养基分装量较大时,可高压灭菌103.43kPa 30min。含糖的培养基高压灭菌55.16kPa 15min以免糖类被破坏。②流通蒸汽灭菌法:凡不耐高温的物质,如糖类、明胶、血清、牛乳及鸡蛋等培养基的灭菌,可用流通蒸汽灭菌,温度通常是100℃,加热15~30min,可杀死细菌繁殖体。③血清凝固器灭菌:含血清、鸡蛋的培养基,可用血清凝固器进行间歇灭菌,于第一天加热至75℃维持30min;第二天80℃30min;第三天85℃30min,每次灭菌完后取出培养基放在37℃温箱中培养一夜,第2天再灭菌,连续3次即可达到灭菌目的。最后放冷暗处或冰箱中保存备用。④水浴低温灭菌法:此法较为少用,是将用血清、腹水、组织液等配制的培养基在水浴中加热56~57℃,维持1h,以保持呈液体状态,连续5~9d水浴灭菌。

此外,尚有过滤除菌法,可用于糖溶液、尿素液、血清、腹水及其他因加热即破坏的物质,可用滤菌器过滤除菌。

7.检定检定即对培养基质量的检查。每批培养基制成后必须经检定后方可使用,检定时将培养基置37℃温箱内培养24h后,证明无菌,同时用已知菌种检查在此培养基上的生长繁殖及生化反应情况,符合要求者方可使用。

8.保存制好的培养基,通常不宜保存过久,以少量勤做为宜。每批培养基均应注明制作日期,平日少量分装的试管培养基均宜存放在4℃冰箱内,其它基础培养等可保存于冷暗处。