4.实质脏器的采集无菌采集脏器组织块,放入无菌容器内。每块组织应单独放在无菌容器内,注明日期、组织和动物名称。注意防止组织间相互污染。供组织病理学检查的样品要新鲜、不能冷冻,不要挤压,尽量避免造成人为损伤。取材应包括病灶及周边正常组织,组织块的厚度最好不超过1.5cm,要有切面,取材后应及时固定于10%福尔马林溶液中。如作冷冻切片用,则需将组织块放在0—4℃容器中,尽快送实验室检验。供病毒分离用组织器官样品死后立即采集,直接放入灭菌瓶中,不加防腐剂。若样品不能当天使用,有些可用50%的缓冲甘油(pH7.2的Hank,s平衡盐溶液或PBS配制,含复合抗生素)保存。绝大多数病毒是不稳定的,样品一经采集要尽快冷藏。现场采集样品要尽快用冷藏瓶(加干;冰或水冰)将样品送到实验室检验或置低温冰箱保存。如使用干冰应特别注意将样品严密封好,以防二氧化碳(C02)窜人样品,因为有的病毒对酸很敏感(如口蹄疫病毒)。如无法获得干冰或水冰,可用冷水加氯化铵按3:1的比率倒入冷藏瓶中,溶解后将密封好的样品放入其中。不能得到及时检验的样品,一般要保存于-70℃以下。一般忌放-20℃(该温度对有些病毒活力有影响)。
5.体表样品的采集表皮寄生虫检查,可刮取病变组织碎屑或用透明胶带粘取内耳、耳根及颈背部毛根部皮屑,贴附于载玻片上,供显微镜检查(需尽快进行观察,以免虫体爬出)。产生水泡或皮肤病变的疾病,应直接从病变部位采样。可直接收集病变皮肤的碎屑以及未破裂水泡液、水泡皮等作为样品,液体采集后置离心管内,水泡皮等置于灭菌的50%甘油盐水保存液中低温保存送检(液体没过组织即可)。
6.乳汁样品的采集清洗乳头后采样。乳房先用消毒液洗净(取乳者的手亦应事先消毒),并把乳房附近的毛刷湿,最初所挤的3~4把乳汁弃去,然后再采集lOmL左右乳汁于灭菌试管中。进行血清学检验的乳汁不应冻结、加热或强烈震动。
7.胚胎的采集选取完整、无腐败的胚胎置于冰盒中尽快送抵实验室。如果在24小时内不能将样品送达实验室,需先冷冻后运送。
8.精液、尿液及其他液态样品的采集精液样品用人工方法采集,所采样品应包括“富精,部分;尿液宜在早晨采集,在动物排尿时,用洁净的容器直接接取。也可使用塑料袋,固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取尿液。
采集胆汁、脓、粘液或关节液等样品时,用灭菌吸管、毛细吸管或注射器插入蓄积部位,吸取液体物质,然后将其注入灭菌的试管中送检。
9.粪便样品的采集检查消化系统寄生虫,需采取5—10g新鲜粪便。从体外采集粪便,应力求新鲜。或用拭子小心地插到直肠粘膜表面采集粪便,然后将拭子放入盛有灭菌的50%甘油盐水保存液中送检(如做虫卵检查,应用饱和盐水浮游法或离心集虫法尽快进行)。
10.供显微镜检查的脓、血液、粘液及组织抹片的制备方法先将上述样品置于载玻片上,再用另一玻片推抹或滴加盐水后用另一玻片涂抹,涂片自然干燥后,火焰固定按实验要求进行染色后观察。用组织块作触片时,将组织块的游离面在玻片上轻轻蘸抹即可,(涂布样品切记要薄,如细胞重叠,将影响观察结果)。滴加生理盐水后用做暗视野检查或直接镜检的样品,应立即在显微镜下观察。
11.全脑、脊髓的采集切开颅骨,采取脑、脊髓,做病原检查,可将脑、脊髓浸入50%甘油盐水液中,低温状态下送往实验室。做病理学检查,可固定于10%福尔马林液中送检。
第二节样品的处理
一、病毒检验样品的处理
1.器官组织病料将保存于50%甘油缓冲盐水溶液中的器官组织病料用无菌生理盐水洗2~3次后,细细剪碎后放人乳钵中充分研磨。研磨过程中,逐渐加入pH7.2~7.4的Hank‘s液(含500IU/mL的青、链霉素),最后制成10%~20%的组织悬液。置于-20℃环境迅速冷冻,然后于37℃水浴中立即融化,冻融过程可以反复几次,使细胞内的病毒充分释放。以2000r/min离心10~20min后,吸取上清液,作接种用。
2.鼻咽拭子或直肠拭子将棉拭子迅速置于含有2~5mL中性Hank’。平衡盐溶液(含500IU/ml的青、链霉素)的小瓶中,充分挤压,刷洗棉拭子。必要时可反复冻融3~5次,收集其液体部分,以2000r/min离心10-20min,吸取上清液,作接种用。
3.血液样品用作病毒分离的血液样品,可以是全血也可以是血清,要根据病毒的感染类型而定。采集全血时可加入肝素或枸椽酸钠作为抗凝剂。
4.分泌物或渗出物将采集的分泌物或渗出物用pH7.2~7.4的Hank,s液作3.5倍稀释。这类样品常含有大量细菌,需做除菌处理,可加入青、链霉素各1000~2000IU/Ml,4℃4h或过夜,2000r/min离心20min,吸收上清液,用于接种。病料悬液也可经离心去沉渣后,用细菌滤器过滤除菌,滤过液用于接种。
5.粪便病毒在粪便中的含量较少,所以一般取5~10g以上的新鲜粪便,或直接从肠管内取样。用pH7.2-7.4的Hank,s液将粪便稀释10—20倍,Hank.s液应含有1000~2000IU/mL的青、链霉素和2.5ug/mL的两性霉素B或40ug/mL的制霉菌素,4℃过夜,2000r/min离心20min,取上清液用于接种。
6.无菌的体液胸水、脑脊髓液、心包液和无菌导尿液等可不做任何处理,直接用于接种。
二、细菌检验样品的处理
1.用于细菌分离培养病料的处理严格无菌采取的待检病料,可不经处理直接接种于培养基中,进行分离。对于污染较严重的病料,在接种培养基前,必须根据污染杂菌的程度及性质进行适当处理,然后进行分离培养。
2.加热处理法当怀疑病料中的病原微生物为芽胞菌时,可将待检组织加灭菌生理盐水研磨(液体待检病料则不必)作成1:5~1:10倍的稀释液,置75℃水浴箱中,加热30min,或80℃经15~20min,以杀死微生物和繁殖体(包括杂菌及病原菌),而细菌芽胞仍存活,然后将处理过的待检病料接种到适当的培养基上,即可获得纯培养。
3.接种易感动物把待检病料接种易感动物,待其发病死亡后,取其血液或组织器官材料,接种到培养基上。利用这种方法不但可以从污染的病料中分离出病原菌,而且还可以确定病原菌的致病性和毒力。
4.化学药品处理有些化学药品对某些微生物有极强的抑制力,而对另一些微生物则没有抑制作用或作用很小。因此,可将适宜的化学药品加入培养基中分离微生物。如培养基中加入一定量的龙胆紫则可抑制许多革兰氏阳性菌的繁殖,有利于阴性菌的分离培养。用50%的酒精或0.1%升汞水溶液处理真菌性病料几分钟,再用灭菌水洗涤,就可杀死部分污染的杂菌。
三、用于动物试验样品的处理
1.胸水、脑脊髓液、血液、心包液、尿液和分泌物等。可不做任何处理,直接接种动物。
2.脏器等组织。取被检病料放于无菌研钵中,用灭菌的剪子将组织剪成碎粒。加人灭菌海砂少许再进行磨细,再加人生理盐水少许继续研磨,静置片刻,使悬浮组织下沉,然后用注射器吸取上清液供注射用。如供静脉注射用,常用低速(1700r/min)离心15min,再吸取上清液作注射用。
3.细菌培养物。液体培养物可直接用于注射。固体培养物先用生理盐水或肉汤培养基洗刮菌苔,然后倾于小烧杯中吸取。注意悬液制成后存放时间不能过长。
第三节样品的记录包装与运送
一、样品的记录
送往实验室的样品应有一式二份的送检单,一份随样品送实验室,另一份留送检方备案。样品记录至少应包括以下内容:
1.畜主的姓名和畜禽场的地址;
2.畜禽场(户)里饲养的动物品种及其数量;
3.被感染的动物种类;
4.首发病例和继发病例的日期及造成的损失;
5.感染动物在畜群中的分布情况;
6.死亡动物数、出现临床症状的动物数量及其年龄;
7.临床症状及其持续时间,包括产奶或产蛋的记录,死亡情况和时间,基本病理变化,免疫和用药情况等;
8.饲养类型和标准,包括饲料种类;
9.送检样品清单和说明,包括病料的种类、保存方法等;
10.动物治疗史;
11.要求做何种检测;
12.送检者的姓名、地址、邮编和电话;
13.送检日期等;
14.采样人和被采样单位签章。
二、样品的包装
1.每个组织样品应仔细分别包装,在样品袋或平皿外贴上标签,标签注明样品、样品编号、采样日期等。再将各个样品放到塑料包装袋中。
2.血清、拭子样品装于塑料离心管中,应分别放特定塑盒内。
3.包装袋外、塑料盒及铝盒应贴封条,封条上应有采样人签章,并注明贴封日期,标注放置方向。
三、样品的运送和保存
1.所采集的样品要以最快最直接的途径送往实验室。
2.如果样品能在采集后24h内送抵实验室,则可放在4℃左右的容器中运送。3.只有在24h小时不能将样品送往实验室并不致影响检验结果的情况下,方可将样品冷冻,并维持低温状态运送。
4.根据试验需要决定送往实验室的样品是否放在保存液中运送。
5.要避免样品泄漏。装在试管或广口瓶中的病料密封后装在保温箱内加冰袋运送,要包装或用封口膜防止试管和容器内容物泄漏。如需寄送,装箱时要垫上足够的缓冲材料。
6.制成的涂片、触片、玻片上做好标记,火焰固定,并另附说明。玻片最好放在玻片盒内,在保证不被压碎的条件下运送。所有样品都要标注详细标签。
7.各种样品到达实验室后,应按有关规定冷冻保存。长期保存的样品应超低温冷冻(以-70℃或以下为宜)保存,尽量避免反复冻融。