亥姆霍兹从不认为自己是位心理学家，因为他的最主要兴趣在物理学上。尽管他将职业生涯的最初20年在很大程度上奉献给了生理学，但他在这一时期的目标，却是要用感觉器官和神经系统的物理学术语来解释感知现象；在此过程中，他的努力对实验心理学产生了巨大影响。然而可笑的是，在他那个时代，亥姆霍兹最著名的科学成就竟是检眼镜的发明。这个小东西总共仅花费他8天时间，且他自己也认为不值一提。然而，正是有了这个小玩意儿，医生们才得以第一次真正地察看活体视网膜。
亥姆霍兹一跃而为其所处时代中名列前茅的科学家——他所取得的成就使其赢得贵族称号（姓名前的“冯”字即由此而来）——但比起他最崇拜的科学家，争强好胜、阴沉和隐遁的伊萨卡·牛顿来，他完全是另外一种人。他对其他科学家或同事们既客气，又慷慨，在私生活上，表现为一位极为正常的中产阶级教授先生，其生活平淡如水。
他的父亲是波茨坦一所专业学校的哲学和文学老师，薪水很低。他从父亲那里继承来古典文学和哲学的深厚根基；经过医学培训之后，他在穆勒的指导下完成了学业论文，入伍后成为一支军团的外科医生，并在那里服役5年；他在接到第一份学术职位时娶下妻子，生育两个孩子后他成为鳏夫，再娶妻子，又生三子。他的职业生涯一路攀升，大学越来越好，职位越晋越高，学术成果越来越多，社会地位越来越高。他从未卷入过名誉权纷争，且只加入过一次学术争论。根据记录，他惟一的爱好是古典音乐和登山运动。
亥姆霍兹在部队服役时即开始了他的研究生涯。当时是在和平时期，他拥有较多的空闲时间，因此，他在营房里搭起一间实验室，在这里进行青蛙解剖实验，目的是支持一种机械主义的行为观点。他测量出青蛙产生的能量和热量，并设法以青蛙摄取的食物的氧化量进行解释。在今天看来，这件事情毫无新鲜感，但在1845年，许多生理学家都是“活力论者”，他们相信，生命的过程部分地受到由非物质和不可感知的“生命活力”的控制，这种活力后来被翻版为灵魂（认为其存在于所有的生物之中）。
亥姆霍兹坚决反对这种准神秘化观点。他以自己对青蛙的实验数据和学到的物理知识为基础，写出一篇论文，题名叫《力的守恒》，并于1847年提交给柏林物理学会。他的论点是，所有的机器都遵守能量守恒的法则，因此，永恒的运动是不可能的。然后，他说，有机物的过程也是这样，如果没有能量来源，生命活力也就违反这条法则，因而也是不存在的。简单地说，他将生理学建立在牛顿力学的立场上。这篇文章使他赢得较高的声望，普鲁士政府于是不再要求他服兵役，转而让他在柏林人文科学院任解剖学讲师，一年以后，又指派他担任哥尼斯堡大学的生理学教授。
在余下的二十多年里，亥姆霍兹将大部分时间全部投入了对感觉和感知生理学的研究。（从那时起，他认为自己主要是柏林大学的物理学家。）
他的第一个历史性研究成果是测量神经冲动在神经纤维上的传递速度。他的老师穆勒跟同时代的大部分生理学家一样，采纳了伽伐尼（Galvani）的神经冲动电质说，认为神经系统类似于一卷连续的电线，电流以极高的速度在里面流动——根据一种猜测，其速度几近光速。然而，亥姆霍兹的朋友杜布瓦·雷蒙德早已从化学上分析过神经纤维，认为这些冲动不一定是电流，而是电化学形式。若如此的话，其速度则相对较慢。
亥姆霍兹在哥尼格斯堡大学的实验室里着手测量青蛙运动神经的冲动速度。由于当时还没有瞬时计——第一台瞬时计尚处在开发过程中——他只好创造性地把一台检电计绑在青蛙腿上（运动神经搭在上面），这样，一根在旋转鼓上画直线的指针会显示电流通过神经上半端到青蛙腿踢蹬之间的时间差。了解到刺激与足肌之间的距离之后，亥姆霍兹就可以计算神经冲动的速度；实验证明，这个速度相当缓慢，约为每秒90英尺。
他还测量到人类受试者神经冲动的速度。他请来志愿者，给他们的脚趾或大腿上施放微弱的电流，要求他们在感到电流时，立即举手示意。这些实验得出的数字为每秒165～330英尺不等。然而，亥姆霍兹认为，这些数字没有从青蛙腿上得出的数字准确可靠。有关人体测试的某些结果总是具有较大的可变性。
他于1850年将实验结果发表，但并不为人接受，因为它们难以置信。生理学家们仍然相信，在神经系统里面流动的，要么是非物质的活力，要么是电流，而亥姆霍兹的数据却支持另一种不同的理论，也就是说，神经冲动是由复杂的粒子运动构成的。另外，他的发现与常识相悖。我们的手指或脚趾只要碰上就有感觉产生。如果我们产生移动手指或脚趾的想法，它们也是立即就行动起来的。
但事实证明，他的证据无法反驳。经过初期一阵抵抗之后，他的理论最终还是赢得了广泛的认同。即使他一生没有做过任何别的事情，仅这一点就可以使其在心理学史上永垂不朽，因为这个发现所铺平的道路，如艾德温·波林所言，“是实验心理学今后所有的工作都必须走的，如心理活动及反应时间的测时法……它使灵魂回到了时间里，它把无法说清的东西测量出来，它在实际上捕捉到了自然科学的劳作中心理的最基本代理者。”
我们在此稍作迂回，观看18年之后所出现的亥姆霍兹的研究的一个重要旁支：较高级心理过程的首次速度测试。
一位名叫弗兰西斯科斯·孔奈尼亚斯·当德斯（Franciscus Cornelius Donders，1818～1889）的荷兰眼科医生，在亥姆霍兹研究的启发下所进行的一次尝试。他没有任何心理学背景，然而他认为，因为神经冲动需要时间传递，较高级的心理活动应该也需要时间。他提出假设，刺激与有意反应之间发生的延迟，一部分是因为神经传递，另一部分也因为思维过程所占的时间。
当德斯于1868年设计并进行了一次想像的实验，以检测他的假想，并测量工作中的心理过程。他让受试者对同一个毫无意义的词汇做出反应，如ki，并要求说出这个词的人以尽可能快的速度重复它。在旋转鼓上记录轨迹的指针会记录两个ki之间的震动，两个微动之间的距离则成为时间延迟的度量。
在最简单的情形下，受试者知道将会听到什么样的声音，也知道如何做出正确的回答。刺激与反应之间的延迟因此就是简单反应时。然而，如果受试者需要进行某种思考活动，又会怎么样呢？如果实验者一连说出几个词中的任何一个，如ki，ko，ku，而受试者得尽快地模仿这些声音，结果又会怎样？如果这一次的反应比简单反应所花的时间更长的话，当德斯认为，这个差别就应该是两种心理活动——辨别（在听到的声音中）和选择（选择正确的反应）——中的时间差。
当德斯还想到了把两种心理活动分开并获取各自尺寸的办法。他告诉受试者，他们可能听到ki，ko或ku，可要模仿的只能是ki，对其他几个声音则应保持沉默。因为不需要重复ko或ku，他们就得辨别这些声音，而不选择反应。从辨别加选择的时间里减去辨别的时间，当德斯认为，得到的应该就是选择时间。
结果令人吃惊。平均而言，辨别比简单反应时多出39毫秒，而辨别加选择时比简单反应时又多出75毫秒。因此，选择要花去的时间为36毫秒。
当德斯乐观地创造出一系列更为复杂的过程。他认为，每种心理活动所花费的时间会增加其他活动已经花费的时间，而且，每种活动时间都可以通过减法测量出来。然而，结果并不如愿。时间差被证明是不可靠的，因为只有少数时间可以增加。后来的心理学家于是极大地改善了当德斯的方法。
然而，他毫无疑问地显示，涉及认知活动的反应所花费的时间的一部分是由这个活动占去的。更为重要的是，他认为反应时可以用来研究看不见的心理活动，对他的工作所做的最近的一项评价说，“在当德斯发现测量较高级的心理活动的方法之后，一个新的时代开始了”。
我们再返回1852年的亥姆霍兹。确定了神经冲动的传递速度并发明检眼镜之后，他开始对颜色视觉产生兴趣。自从牛顿于1672年发现太阳的白光是所有可视彩光的混合之后，生理学家和心理学家争相尝试着察看眼睛和心理是如何感知色彩的。最让人困惑的是，当所有色彩的光混合在一起时，我们看到的是白色；而当两种互补色，比如红色的某个色调与蓝绿色的光线混合在一起时，同样也是白色。同理，我们看见纯橘红光线的时候会看见橘红，而当红色和黄色光线混合在一起时，也会变成橘红。
作为物理学家，亥姆霍兹知道，三种特别的色彩——红、蓝紫和绿的特别色调——按合适的比例混合在一起时，可以重新产生其他任何色彩。它们都是原色（所谓颜料的原色，即红、蓝和黄，更准确地说，应该是洋红、蓝绿和黄色。色素吸收光线，也反射光线，把这些原色混合在一起的结果，当然与混合光线的结果大不一样）。他推想，这就意味着人类视力可以检测出这三种色彩。
他进一步提出假说，视网膜一定有三种不同的受体细胞，每种细胞配有一种对某种原色非常敏感的化学物质。他依靠穆勒的特定神经能量的理论推想，从每个感受器伸向大脑的神经不仅传递视觉信息，而且还传递特别的色彩信息。
一位叫托马斯。扬（Thomas Young）的英国科学家曾于1802年想到过类似的理论，但他没有实验证据，因而被人们忽略了。但亥姆霍兹却收集到大量证据，其中包括，当不同色调的光线混合在一起时，我们所体会到的色彩；当紧盯某种强烈的色彩看过一阵后，我们看到的互补色的后像；存在于一些人畜中的色盲现象；某种大脑损伤对色觉产生的影响等等。他慷慨地承认扬的发现在先，因而，他对色觉的说法自此后就被称作扬一亥姆霍兹理论（或三色理论）。
三色理论是一项了不起的成就。它是一种可检测的、有关心理如何感知色彩的机械论解释。根据一个个的连接，亥姆霍兹从外部世界到大脑的接受区构筑了一根因果现象的链条，从而结束了哲学家和生理学家的许多猜想。它的形式虽然过于复杂，但至今仍然在色觉理论中居于支配地位，彻底推翻了每一种感受器中的神经携带不同种类的能量这一观点。
至于由德谟克利特、贝克莱、休谟及其他人就感知而提出来的一个深刻而令人困惑的问题——我们看见的是否就是外部世界的真正映象——亥姆霍兹比穆勒更趋向于机械论，认为这个问题根本没有意义，大可不必给予考虑：
在我看来，除了，实际的真理之外，任何谈论我们思想中的其他真实性，均不具备任何意义。我们对事物的概念只有符号。也即事物的自然信号。我们学会如何使用这些符号，以调整自己的活动，改善自a的行为。如果知道如何正确地阗读这些符号，我们就可以借助它们调节自己的行动，从而带来所需要的结果。也就是说。所预期的新的感知就会来临……因此，询问我们所看到的朱红（硫化汞）是不是真正的红色，或是不是我们的感官错觉，是没有任何意义的。红的感觉就是正常的眼对自朱红上反射出来的光线的正常反应……但认为从朱红上反射出来的光波具有某种长度，则另当剔论。如果不考虑人类眼晴的特别本质，这个说法则是完全正确的。
这样一来，这位机械主义的生理学家摇身变成一位心理学中的哲学家，而且他也值得人们这样看待。
亥姆霍兹的色觉研究，只是他在许多年里对视觉全面探索的一个部分。他的研究成果，即《生理光学手册》（Handbook of Physiological optics，1856～1867），长达50万言（约100万汉字）。书中除了阐述自己的研究成果之外，还概括了前人在这方面进行的所有研究。此后的好几代人中，该书一直是眼睛光学和神经性研究的权威论著。他还就听觉写过一部类似的著作，只是稍薄一些而已。
在《生理光学手册》中，亥姆霍兹主要处理了视觉的物理学和生理学问题，并就生理学的过程进行了敏锐观察，认为可以借助心理过程，对来自视觉神经的信息进行解释。他在感觉（任何颜色的光线对视网膜的刺激及因之而来的视觉神经冲动）和知觉（心理根据接收到的冲动形成的有意义的解释）之间做了非常有价值的区分，而以前的心理学家们一直搞不清楚这个问题。对于其他感觉系统的信号输入，他也做出了同样的区分。
这种区分对亥姆霍兹的认识论至关重要。他同意康德的观点，认为感觉是由心理来解释并赋予意义的，然而，他不同意康德所认为的心理天生具有提供这些意义的“范畴”和“直觉”的观点。反过来，他宣称，心理在尝试与过错中学会了解释感觉，也就是说，意识在不断地感悟视感觉中传来的信息，观察哪些反应会产生预期的结果，哪些与预期的结果相违。
空间感即为再好不过的例子。康德认为，心理天生就能直觉出空间关系；亥姆霍兹争辩说，我们是通过无意识的推理来认知空间的。在孩童时期，我们一点点地得知，如大小、方向和色彩强度等视觉线索，与物体的远近、左右上下方位等，大有关系；通过经验，我们慢慢对空间关系形成正确的判断。（观察过3个月的婴儿试图抓住一个物体的父母，大都清楚这个过程。）
英国的实证主义一联想主义者们也曾发表过相似的言论，他们同样也缺乏实际的证据以证明自己的观点。作为彻底的实验科学家的亥姆霍兹，却能通过研究搜寻到许多证据。
他还突然想到，如果颠倒抵达受试者大脑的空间感——他的理论如果正确的话——则受试者应该能够适应这种倒错的视觉，并学会正确地解释它。于是，他做出一副带棱的眼镜，使物体出现在实际位置的右边。当戴着这样眼镜的受试者试图碰触面前的物体时，结果却错过了，因为他们的手伸向了一个物体看上去所在的位置，但不是物体实际所在的位置。
接下来，他让受试者戴着眼镜继续拿取物体，然后碰触实际位置上的物体；他们开始有意识地朝眼镜中看到的物体的左边伸手。几分钟后，他们都能很快且毫不犹豫地按照物体的实际的位置拿取物体，因为他们已经经历了知觉适应，他们已经重新解释了从视觉神经传递过来的信息，从而做出了对现实的相对关系的正确判断。
然而，当摘下眼镜再去拿取物体时，他们却又错过了，所有的手都伸到了实际物体的左边。这就说明，正常空间感需要一段时间进行复原。