母种可采用引种，也可采用菌丝、孢子和子实体组织分离法培养获得。通常采用子实体组织分离法较易成功。
（1）组织分离。选取八九成熟且健壮无病的菌蕾，在接种箱或接种室内进行组织分离。先用75%酒精进行菌蕾表面消毒，再用无菌水漂洗数次。然后撕开薄膜，用解剖刀将菌蕾纵向二等分切开。从其内部菌柄顶端切去2~3毫米的组织块，用接种针挑取迅速放入备用的斜面培养基试管中，塞好棉塞。
将接入组织的试管放入培养箱中，置于15℃~25℃培养。5~7天后检查是否长出白色菌丝和有无杂菌污染，选出发菌快、无污染的试管继续培养25~30天菌丝长满斜面即为母种，可用于转接扩种。一般每管可转接20~30支试管，不及时使用的，可暂时置于10℃以下低温环境保存。
（2）菌丝体分离，选取两端有节、中空、表面布满竹荪绒毛菌丝的地下竹根数节，用0．2％升汞水溶液浸泡后，再用75％酒精擦洗表面，然后用无菌水漂洗数次后吹干。用刀剥去外层，将竹根纵向剖开，用刀从内壁削取有绒毛状竹荪菌丝的薄竹片，将其切成火柴棒大小。用镊子夹入试管斜面中央，置于培养箱内15℃～25℃下培养，提纯分离即得母种，转接扩种与组织分离法相同。
（3）孢子分离，取健壮、无病虫、无伤口、卵形尚未裂口的大型菌蕾，用清水洗净表面泥沙等污物，用0.2％升汞水溶液浸泡1分钟，再用无菌水漂洗数次。然后，将放有铁圈的玻璃器皿或烧杯置于搪瓷盘中，将菌蕾放在铁圈上面即时盖上钟形罩，在20℃～25℃下培养。待菌蕾破壳，孢子体液变为黏稠状时，连罩搬入无菌接种箱。将孢子液用无菌水稀释后注入试管斜面，每管2～3滴，置于23℃下培养。当菌丝长到1／2斜而时，进行转管纯化，获得母种。