二次发酵的操作注意事项如下：
（1）如果用旧菇房进行二次发酵，应对菇房进行彻底清理消毒。发酵结束前一天，还应配合后发酵效果，用药剂处理一次。
（2）后发酵所用菇房面积不宜过大，以200平方米以内为宜，密封程度要好，以保证室温、料温的控制。
（3）应保证前发酵培养料达到一定的质量要求，前发酵最后一次翻堆时，应根据情况如后发酵加温方式、菇房结构特点、栽培菌株等，调节好料的含水量，进房后不应再调水。
（4）进料时，培养料应堆放在中上层床架，顶层与最下层原则上不放料。因顶层有冷凝水，最下层温度低。各层放料时应尽量堆松，以利于空气交换，切忌压实。
（5）后发酵加温时，不能让热源紧靠培养料，以免部分培养料过干、过湿、过热。同时要注意不要让煤烟、煤气等扩散在菇房内。要正确处理好温、湿、气之间的关系。
（6）严格控制后发酵时的料温。前期升温时，不应超过65℃，以免大量高温放线菌繁殖，造成营养损耗过多，温度应维持在60℃左右。控温时，最好稳定在48℃～52℃，温度波动不要过大。如果控温阶段温度低于45℃，易造成细菌感染。可根据培养料生熟程度，再升温进行巴氏消毒一次。控温后，料温要缓慢下降，避免大风突然降温，防止室外杂菌进入。
（7）根据前发酵后培养料成分和腐熟程度来确定后发酵时间。如果前发酵时间长，料较熟，后发酵时间可短一些，反之则相应拉长一些。