班超在西域30多年，对巩固当时东汉的西部边疆、促进多民族国家的发展，做出了卓越贡献。也正是由于他再通西域，使东汉恢复了对西域的统治，保卫了“丝绸之路”，促进了中国同中西亚各国的经济文化交流。
永平十六年（73年），班超初使西域，只带了36个随从。在鄯善国，国王非常恭敬客气地招待了班超，但没过多久就疏远了。班超知道是匈奴的人来与他争夺鄯善国了。他对部下说：“不入虎穴，焉得虎子。当今之计，必须靠智勇消灭匈奴的使者，震吓鄯善人，使他们臣服于我们。”当天夜里，班超率领36人在狂风中袭击了匈奴人的驻地，班超先顺风放火，再前后鼓噪。虏众惊乱，班超亲手格杀三人，手下斩匈奴的使者及从士30人，其余一百多人都烧死在帐中。当第二天班超把匈奴使者的首级给鄯善国王看时，“一国震怖”，赶紧把自己的儿子当人质并归降于汉朝。
过了不久，班超又率领他的36将出使于阗国。当时，于阗王在西域南道称雄，匈奴遣使者监护其国，掌握着国中的实权。于阗国王对班超及其部下的到来很冷漠，该国国民都非常相信巫术，有巫师言：“你们留容汉使将惹天怒，汉使有一匹浅黑色的马，马上去取来献给我。”国王便派人向班超要马。班超要求巫师亲自来取，不一会儿巫师就大摇大摆地来了，班超一刀就把他的头砍了下来，以送国王。于阗人早就听说班超在鄯善诛灭匈奴使者的事迹，非常地惶恐，立刻杀了匈奴的使者投降汉朝了。由于鄯善、于阗的归降，西域南路的一些小国也纷纷仿效，如此，丝绸南路的通道就此打通了。
第二年，班超为了打通西域的北道，率领他的手下向天山最西端的疏勒国进发了。当时的疏勒国王被他的邻国龟兹所杀，另立了一个名叫兜题的龟兹贵族做了疏勒的国王，疏勒国民不满之情溢于疏勒全国。班超授计田虑智擒兜题，立新王，疏勒国人非常高兴。
由于胡人的叛服无常，加上经营西域需要强盛的经济实力做支撑，汉章帝登位后，听从了放弃西域的主张，命令班超等人撤回汉朝，重闭玉门关。当班超要离开疏勒时，疏勒举国忧恐，有一个督尉竟以刀自刎，死前说：“我实在不忍看见班超离开，因为他一离开，我们必被龟兹所灭。”班超离开时，国王和王侯们也都为他们的离开而呼号悲戚，很多人匍匐在地，抱住班超等人的马腿不让他们走。看到这种情景，班超和他的手下毅然违抗了圣旨留了下来，重新回到了疏勒。在以后的三年中，班超率领疏勒、康居、居弥各国的兵马一万多人攻占姑墨石城后上书皇帝，建议用以夷制夷的方法管理西域，汉章帝大为赏识，派兵千余人来支援班超。在此后20年里，班超转战南北，纵横东西，大小十几战，从无败绩，且多以弱胜强，使得西域五十余国归附汉朝，解除了西域之忧。基于他的莫大功劳，在他63岁那年，被封为定远侯，邑千户。
102年八月，班超71岁。在多方的努力下，年迈的他终于回到了久别了31年的大都——洛阳。九月，班超就与世长辞了。
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“投笔从戎”的典故
班超为人有远大的志向，不计较一些小事情。在家中孝顺勤谨，过日子常常辛苦操劳，不以劳动为耻辱。他能言善辩，粗览了许多历史典籍。公元62年（永平五年），哥哥班固被征召做校书郎，班超和母亲也随同班固到了洛阳。因为家庭贫穷，班超常为官府抄书挣钱来养家。他长期抄写，劳苦不堪，有一次，他停下手中的活儿，扔了笔感叹道：“大丈夫如果没有更好的志向谋略，也应像昭帝时期的傅介子、武帝时期的张骞那样，在异地他乡立下大功，以得到封侯，怎么能长期地在笔、砚之间忙忙碌碌呢？”旁边的人都嘲笑他，班超说：“小子怎么能了解壮士的志向呢！”