周恩来积极争取西安事变和平解决，实现了国共合作，一致抗日。从1937年与国民党谈判到帮助阎锡山进行山西抗战，从1938年担任国民政府军事委员会政治部副部长到1943年重回延安，周恩来一直与国民党打交道。
在陕甘根据地的局面初步稳定下来后，中共中央就在1935年12月在瓦窑堡召开了政治局扩大会议。会议所阐述的关于建立抗日民族统一战线的理论和策略，既说明在抗日前提下，有必要和有可能与民族资产阶级以至地主买办阶级中的一部分力量重新建立统一战线，也着重说明无产阶级在统一战线中能够和必须掌握领导权。会议上，党决定成立东北军工作委员会，以周恩来为书记。瓦窑堡会议后，中共中央进一步加强了对统一战线工作的领导，重要的一方面就是尽可能地向国民党上层领导人和军队将领宣传党的抗日主张，开展争取同盟者的工作。
共产党与国民党军队将领的接触是从东北军开始的。通过先期的联系与接触后，周恩来于1936年4月9日在延安城内一座教堂中与张学良会谈。张学良接受中国共产党关于停止内战共同抗日的政治主张，并提出争取蒋介石抗日的意见。双方还商定了红军与东北军互不侵犯、互派代表等事项。中共中央委派刘鼎作为中共驻东北军代表，在西安进行工作，并由周恩来统一主持对东北军和第十七路军的统一战线工作。
1936年12月12日，西安事变突然爆发，这次事变是张学良、杨虎城两位将军为了促使蒋介石改变“攘外必先安内”的错误政策、实行抗日救国而发动的。中国共产党在事变前并未听闻这件事。事变一发生，张学良立刻致电中共中央，希望听取中国共产党的意见。当天深夜，毛泽东、周恩来复电张学良：“恩来拟来兄处，协商大计。”17日晚，周恩来乘坐张学良的专机抵达西安。当晚，周恩来与张学良一直谈话到深夜。张学良的主张是，只要蒋介石答应停止内战，一致抗日，就应该放蒋，并拥护他做全国抗日的领袖。周恩来对张学良的看法明确表示同意，并向他分析了对蒋介石的不同处置方法可能导致两种截然不同的前途：如果说服蒋介石抗日，就能争取一个好的前途；如果杀了蒋介石，可能会使中国的前途更坏。周恩来提出这样明确的意见，加强了张学良和平解决西安事变的决心。
周恩来与张学良见面当天就一起商定了五项条件，要求停止内战，一致抗日。18日，周恩来拜会了杨虎城。在杨虎城对蒋介石能否抗日心存疑虑的情况下，周恩来进行了解释，两人就这一问题也达成了一致。
周恩来除了与张学良和杨虎城会谈之外，对于东北军、十七路军其他高级将领、中下级军官以及社会各界人士中一些有不同意见的朋友，周恩来也做了不少的工作，一一清除他们思想上的障碍，为和平解决西安事变创造条件。
南京方面在弄清张学良、杨虎城和共产党并不想加害蒋介石，而希望和平解决此次事变的态度后，于22日正式派出谈判代表宋子文、宋美龄等赴西安谈判。23日，双方开始正式谈判。蒋方代表宋子文，西安方面张学良、杨虎城作为代表，周恩来作为中共中央全权代表也参加谈判。周恩来遵照中共中央12月21日的指示，在与张学良、杨虎城共同商讨并进行同南京方面谈判中，做了大量卓有成效的工作，经过两天的谈判，双方达成了停止内战、抗日救国的六项条件。12月24日晚，周恩来会见蒋介石，当面向蒋介石说明中国共产党抗日救国的政策，蒋介石表示同意谈判议定的六项条件，但他要求不采取签字形式，而以他的人格担保履行这些条件。
12月25日下午3点多钟，张学良在连周恩来也没有通知的情况下，秘密陪同蒋介石夫妇及宋子文等赶赴机场，并亲自陪同蒋介石坐飞机离开西安抵洛阳。当周恩来得到消息赶赴机场时，飞机已经起飞。周恩来后来曾说：“张汉卿就是看《连环套》那些旧戏中毒了，他不但摆队送天霸，还要负荆请罪啊!”
26日，张学良陪蒋介石抵达南京，一到南京，蒋介石就扣留了张学良，消息一传开，西安的整个形势就变得动荡不安了。东北军一下子没有了领袖，主张主和的元老派与激进的少壮派的矛盾日益加深。在这种情况下，周恩来一直同各方面广泛接触，宣传一定要坚持和平，并多次与激进的少壮派谈话，但少壮派一直不放弃以武力营救张学良的想法。当他们得知1月31日的最高级会议主张和平解决时，就认为是王以哲、何柱国等元老派破坏的结果。于是在2月2日上午一批少壮派军人闯入王以哲住宅，枪杀了王以哲，内战的危险重又出现。
在王以哲被害后1小时，周恩来即赶往他家吊唁，以实际行动解除了一些人对共产党的误会。接下来周恩来又把少壮派主要人物孙铭久、应德田、苗剑秋送到云阳红军驻地，再转往平津，使得要替王以哲报仇的人失去了目标，从而避免了东北军内部的一场自相残杀。但不管周恩来如何努力，东北军的裂痕已无法弥补，在“二二事件”后，东北军人心涣散，更有高级将领发生分化，2月8日，中央军和平进入西安。
西安事变的和平解决，结束了十年内战，开始了国共合作的新时期。周恩来在这一事件中所表现出来的临危不惧、沉着机智、力挽狂澜，显示了一个伟大政治家与战略家的雄才大略。
从1937年2月开始，周恩来先后在西安、杭州、庐山和南京4地，同国民党进行了5次谈判，历时7个月，谈判的对手从最初的顾祝同一直到蒋介石本人。在历经道道波折后，终于扫清重重障碍，推动了第二次国共合作的实现。
谈判的最后成功是在1937年8月的国防会议上。8月10日，周恩来、朱德、叶剑英飞抵南京，参加国防会议。在这次谈判中，周恩来坚持原则性与灵活性的统一，与蒋介石达成了红军主力部队改编为国民革命军第八路军、长江南北红军游击队改编为国民革命军陆军新编第四军的协议。周恩来7月所起草的《中共中央为公布国共合作宣言》也于9月22日由国民党中央通讯社公布。同时，蒋介石发表谈话，在事实上承认中国共产党的合法地位。第二次国共合作终于实现，全民族抗战出现了新局面。周恩来负责的这5次谈判，正确把握了局势，恰当处理了两党关系中许多长期积存下来的复杂问题，为第二次国共合作实现扫清了道路。
1937年8月，中共中央政治局在洛川召开扩大会议。周恩来在会上当选为中共中央革命军事委员会副主席。9月初，周恩来前往山西，并在山西工作近3个月。
周恩来一到山西便向阎锡山分析抗战形势，说明日本军国主义是可以打败的，敌人会一天天弱下去，我们会一天天强大起来，鼓励阎锡山坚持抗战。
周恩来针对阎锡山搞的阵地防御战，提议不要单纯死守雁门关，而应主动出击，实行侧击和伏击来破坏日军的进攻计划，阎锡山对此表示满意。
1937年9月平型关一役，是中国抗战以来的第一次大胜利，作为中共中央代表的周恩来对平型关战役的策划和发动起到了重要作用。战前，他和朱德同阎锡山研究平型关战役的计划，决定用运动战来配合阎锡山所拟的平型关作战计划，结果证明这一计划是很成功的。
平型关战役后，山西战局中心转到了忻口会战上。在会战前，周恩来多次向阎锡山、卫立煌等建议，不要一味侧重于正面堵击与阵地战，而应加强侧面部署和后方打击，在运动中寻找战机，但他的这些建议并没有完全被采纳。在接下来的忻口会战中，国共两党军队配合较好，取得了一些小战役的胜利，但仍不能扭转整个会战的失败。10月31日，阎锡山下令放弃忻口。11月8日，太原失陷。周恩来一直到11月5日，他才和八路军驻晋办事处最后一批人员撤出太原。
在这期间，周恩来还对华北的敌后游击战的全面展开作出了重要贡献。10月，他在原有游击队的基础上，武装民众，组织游击队，后来他征得阎锡山同意又发枪四千支来武装民众开展游击战。10月25日，周恩来向中央提出了“必须发展绥远游击战争”的战略性建议，中央旋即采纳了这一建议。
太原失守后，临汾成为山西抗战的政治中心。11月16日，周恩来在临汾发表《目前抗战危机与坚持华北抗战的任务》的着名讲演，继续强调发展华北游击战争的意义，强调以游击战争为主体，坚持华北的持久抗战，影响和推动全国抗战的开展。在此之后，八路军在华北敌后的游击战争猛烈地发展起来了，周恩来在后来并同刘少奇一起提出迅速扩大人民军队的主张。
11月25日，周恩来和彭德怀回延安参加十二月会议。会后，他赴武汉去领导长江局的工作和与国民党谈判。作为长江局副书记，周恩来主要负责统一战线方面的工作。1938年3月，经过中共中央同意，周恩来出任国民政府军事委员会政治部副部长。他通过多种形式的宣传活动向民众宣传抗日救国的精神和中国共产党抗战、团结、进步的主张，对动员全民族参加抗日战争起了有力的推动作用。
1938年春，周恩来(左一)和郭沫若(左三)、叶剑英(左四)同八路军副总指挥彭德怀在武汉合影。1938年8月28日，周恩来返回延安参加六届六中全会，会上撤销了长江局，设立南方局，周恩来为书记，10月1日周恩来没等会议闭幕就赶回了武汉。10月7日至9日，周恩来在《新华日报》上发表《论目前抗战形势》的长篇文章，深刻阐述了毛泽东论持久战的光辉思想。这篇文章后来还印成小册子大量发行，使许多人从惶惑中看清前途，坚定了抗战必胜的信念。10月25日，周恩来撤离武汉。
1939年2月23日，周恩来到达新四军军部安徽泾县云岭，向新四军传达中共六届六中全会精神，对新四军今后的活动方针，周恩来反复研究后概括为三句话：“向北发展，向东作战，巩固现在阵地。”这一方针是符合新四军实际情况的重大而正确的决策。但项英并未在实践中很好地贯彻这一战略方针，从而为皖南事变中的惨重损失埋下了根子。
1941年1月4日，皖南事变爆发。身在重庆的周恩来得知情况后立即向蒋介石、何应钦、白崇禧、顾祝同等分别提出抗议。周恩来在得知国民党反诬新四军“叛变”后，为《新华日报》写下了“为江南死国难者志哀”和“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急？!”的题词。这题词一下揭穿了皖南事变的实质，表达了对国民党顽固派最强烈的抗议，在国内外产生了巨大影响。
1943年8月，周恩来回到延安。1945年出席了中国共产党第七次全国代表大会，在会上做了《论统一战线》的报告。在七届一中全会上当选为中央政治局委员、书记处书记，并继续担任中共中央军委副主席。
抗战胜利后，周恩来陪同毛泽东赴重庆谈判，与国民党达成了“双十协定”，后又达成停战协定。1946年6月蒋介石发动全面内战，11月周恩来回延安。1947年3月开始与毛泽东一道转战陕北。
1945年8月15日，日本投降，中国人民迎来了抗日战争的伟大胜利，中国共产党和中国国民党都在考虑中国的未来走向。中国共产党力图避免内战，并且试图通过和平的道路来建设一个新中国，并实现中国的社会政治改革，这也是经历了八年抗战的中国人民的普遍愿望。蒋介石则一心想着把中国领到他独裁的道路上去。但抗战刚结束，蒋介石立即发动内战的时机还不成熟，其部队的大部还在大西南，无法迅速开赴华东、华北和东北；全国人民和美、苏、英三国也不赞成内战，因而蒋介石发动内战就需要一段缓冲时间。
在这种情况下，蒋介石向延安连发三次电报，邀请毛泽东到重庆去共商国是。蒋介石的算盘是这样打的：如果毛泽东不来，就可以宣传是共产党拒绝和平谈判，把内战的责任就推到共产党身上；如果来了，就利用“和平谈判”的幌子来派兵遣将，部署内战。
1946年1月10日，周恩来、张群和马歇尔。8月28日，周恩来陪同毛泽东赴重庆谈判。经过43天艰苦的谈判，10月10日这天下午，《政府与中共代表会谈纪要》即《双十协定》签署。尽管双方并没有就解决中共军队问题和解决解放区政权问题达成一致，但协定的作用是很明显的。“第一个好处是采取平等的方式，双方正式签订协定，这是历史上未有过的。第二，有成议的六条，都是有益于人民的。”
10月11日，毛泽东飞返延安，周恩来留在重庆继续谈判。1946年1月，国共两党达成停止军事冲突的协议。1月10日，周恩来参加有各党派和无党派人士参加的政治协商会议。会上，关于军事问题，周恩来主张政治民主化与军队国家化要同时实行，不能认为先有军队国家化，然后才能政治民主化。经过多次讨论后，决定由周恩来、张治中、马歇尔组成军事三人小组以商定中共军队的整编办法并进行整编，同时按照国民党政府军令部的计划整编国民党军队。
31日晚，政治协商会议闭幕，大会通过了政府组织案、和平建国纲领、军事问题案等五项决议。政协会议的重要性表现在：在以后相当长一段时间内，它成了许多人衡量是非的重要尺度，谁坚持政协路线，谁就深得人心；谁破坏政协决议，谁就不得人心。
2月25日下午，周恩来同张群、马歇尔一起签署了《关于军队整编及统编中共部队为国军之基本方案》，这就是通称的“整军方案”。按照这一方案，中共部队在18个月内编成10个师，为国民党部队的1/5。对于整军方案，周恩来后来指出“在整军方案中，我们在军事上取得了与蒋军的平等地位。抗战八年，蒋以他的统帅地位来压我们，但在谈判过程中，马歇尔来后，为了套我们，在地位上也不得不承认我们与蒋军的平等地位。结果蒋成了一方面的统帅，而不是两方面的统帅”。在整军方案签字后，在全国范围内，内战的炮火确实停息了一段时间。
由于国民党政府宣布还都南京，国共谈判的中心也从重庆转移到了南京。5月3日，周恩来、邓颖超、陆定一、廖承志等飞抵南京。