英国细菌学家弗莱明是青霉素的发现者，他是在一个偶然的机会中发现的。1928年夏季的一天，他像往常一样，在伦敦大学圣玛丽医学院的实验室里，正在研究有关机体中防御因子（特别是白细胞）抵抗葡萄球菌等致病因子的作用机理。
为了研究葡萄球菌，他全身心地投入到实验中去，仔细观察这些细菌在培养过程中所发生的变化，研究影响这些变化的条件。然而每次都会有外来微生物捣乱，每当他将培养皿的盖子打开，取出里面的细菌，放在玻璃片上，准备拿到显微镜下观察时，那些飘浮在空气中的霉菌或细菌，总会"乘机"飘落到培养皿里。
这些外来的微生物甚至还在培养皿中繁殖，这使得弗莱明的实验无法进行，对此，弗莱明真是伤透了脑筋。
然而有一天，弗莱明却在无意中从这些"不速之客"中找到了他多年来一直寻求的抗菌物质。那天，当他正准备用显微镜观察从培养皿中取出的葡萄球菌时，他发现在原来长了很多金黄色葡萄球菌菌落的培养皿里，长出了一种来自空气中的青绿色的霉菌菌落，而且这些物质已经开始繁殖。
更使他惊讶的是，在这个青绿色菌落的周围，原来培植的葡萄球菌菌落竟然全被溶解了，而离得较远的葡萄球菌则依然生长着。弗莱明推测，这个青绿色的霉菌可能会分泌一种能够使葡萄球菌裂解的自然抗菌物质，而这种物质可能正是他多年来刻意寻求的。
自此，弗莱明开始把注意力放在这种青绿色的霉菌上。他把这个偶然发现的奇特现象详细地记录了下来，同时他还异常小心地把这些青绿色的霉菌从培养皿中分离出来，把它培养在液体培养基中，使其迅速繁殖。
在观察中弗莱明发现，这种青绿色的霉菌能分泌出一种极强的杀菌物质，这种物质还可以扩散，正是这种物质消灭了生长在它周围的葡萄球菌。
他把这种青绿色的霉菌称为青霉菌。弗莱明从实验中观察到，即使葡萄球菌布满了培养皿整个平面，青霉菌周围仍旧没有任何细菌生长。这表明青霉菌能阻止细菌的蔓延，并且把它们消灭。
随后，弗莱明又研究如何将这种青霉菌的分泌物提取出来。他立即动手进行了实验，第一步，他把青霉菌接种到肉汤培养液中，让其迅速地繁殖。第二步，他把长满青霉菌的液体异常小心地进行过滤，得到一小瓶澄清的滤液。
随后，他将这种滤液滴进已经长满了葡萄球菌的培养皿里。只用了几个小时，这种滤液就将原来长势旺盛的葡萄球菌全部消灭了。
然而，这还不能让弗莱明满足，他又开始研究这种霉菌对其它致病因子的作用。他在以前研究溶菌酶过程中建立起来的测定技术的基础上，将这种滤液用水稀释后重新做实验，他对这种培养液对各种致病菌的抑制性状进行鉴定。一系列的试验表明1：1000浓度的培养液仍然能抑制葡萄菌的生长。而当时应用最为广泛的消毒剂石炭酸在1：300的浓度时就失去了抑菌功效。此外，弗莱明还以十分凶恶的链球菌作为测试的对象，结果他发现，1：100的培养液就能杀死它们。
由于产生这种物质的是青霉菌，所以，弗莱明称这种物质为青霉素，这就是青霉素的发现过程。
虽然青霉素很早就被发现了，但隔了相当长的时间才被运用到医学上，这是因为提炼医用青霉素的过程相当复杂，要经过青霉素的培养、滤液的浓缩、提炼和烘干等一系列过程，弗莱明自己是无法单独完成的。
因此，为了将培养液中的青霉素提取出来，他邀请了一些生物化学家合作。但是最后所有的试验都以失败告终，这是因为青霉素是一种很不稳定的化学物质，这种物质在一般的溶媒中很快会遭到破坏，因此他也一直没有获得过青霉素的提取物。
但是，这些并不能使弗莱明的决心动摇，因为他坚信，青霉素的应用前景是光明的。十多年以来，他一直在自己的实验室里耐心地、默默地将这个青霉素菌株一代一代地培育下去，功夫不负有心人，最后他终于取得了骄人的成绩。
弗莱明关于青霉素的论文引起了澳大利亚病理学家弗洛里的注意，他向弗莱明索取这种物质作进一步的研究。
弗洛里和当时侨居在英国的德国生物化学家钱恩，在几位科学家的协助下，克服了种种困难，最后终于在1941年，从青霉素滤液中将青霉素的粉末提炼了出来。
经试验，即使把这种棕黄色的粉末稀释到二百万分之一，也足以使病菌丧生，这种青霉素粉末具有前所未有的巨大杀伤力。
青霉素第一次真正用在临床医学上是在1941年，它被用在一位被葡萄球菌感染的病人身上，效果良好。自此，青霉素的显著疗效得到了医药界的承认并开始广泛地普及开来。